HPLC法测定附子不同炮制品、川乌、参附注射液中腺苷的含量

何成军，耿昭，周勤梅，李小红，彭成，郭力

·炮制制剂·

HPLC法测定附子不同炮制品、川乌、参附注射液中腺苷的含量

何成军，耿昭，周勤梅，李小红，彭成，郭力

目的：首次从附子中分得腺苷，并应用高效液相色谱法建立附子不同炮制品、川乌、参附注射液中腺苷含量的测定方法。方法：采用Diamonsil Cl8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液（15:85）；检测波长：260 nm；流速：1.0 mL/min。结果：腺苷在0.062～0.217 μg范围内线性关系良好，R=0.9997，平均回收率为99.9%，RSD=2.41%。结论：本方法可靠、准确、简便，为评价附子不同炮制品、川乌、参附注射液的质量提供了科学依据。

附子；腺苷；含量测定

附子(Aconiti Lateralis Radix Praeparata)为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品[1]，是川产道地药材之一，主产于江油市[2]，主要有黑顺片、白附片、盐附子等炮制品。其性辛、甘，大热；有毒；归心、肾、脾经；具有回阳救逆、补火助阳、祛风寒湿邪之功，用于亡阳虚脱、肢冷脉微、阳萎、宫冷、心腹冷痛、虚寒吐泻、阴寒水肿、阳虚外感、寒湿痹痛。附子被历代医家视为补火之要药，在临床上的应用十分广泛。但是现行《中国药典》中附子、乌头及其不同炮制品都以脂溶性生物碱为指标成分进行质量控制，而附子在临床上主要使用水煎液。本课题利用硅胶柱色谱及重结晶等方法从附子的水煎液中分离得到具有广泛心脏效应的水溶性成分——腺苷，并利用高效液相色谱法对附子及其不同炮制品、川乌、参附注射液中的腺苷进行了含量测定，为其水溶性成分质量控制作补充，使其质量控制更加科学。为附子及其炮制品、川乌及其复方制剂的质量控制和进一步的科学研究提供了参考。

1 实验材料

生附片（批号：20101001）、川乌（批号：20101001）、白附片（批号：20101001）和黑顺片（批号：20101001）购自江油恒源药业集团有限公司（经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.及其子根加工品附子的不同炮制品）；参附注射液购自雅安三九药业（规格：10 mL/支，每 1mL相当于含生药附子0.2 g，批号120204）；腺苷对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号：879-200202）。

Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil Cl8(250 mm×4.6 mm，5 µm)；流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液（15:85）；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：260 nm；进样量：10 µl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取腺苷对照品适量，加甲醇制成1 mL含15.5 μg的溶液作为对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取粉末2.0 g，置具塞锥形瓶中，分别加入0.5%磷酸20 mL，密塞，精密称定，超声处理45分钟，放冷，再精密称定，用0.5%磷酸液补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液过0.45 μm微孔滤膜后作为供试品溶液，备用。

2.4 检测波长的选择

取腺苷对照品溶液适量，于Agilent 1200型高效液相色谱仪二极阵列管(DAD)检测器下200 nm～400 nm范围内进行扫描，确定最大吸收波长为260 nm。

2.5 线性关系考察

精密吸取腺苷对照品溶液4、6、8、10、12、14 μl注入高效液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件进行峰面积测定。以腺苷的进样量(μg)作为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y = 4089.6x + 8.3695, r= 0.9997，表明腺苷在0.062 μg～0.217 μg范围内线性关系良好。见表1，图1。

表1 腺苷线性范围考察结果

图1 腺苷标准曲线图

2.6 精密度试验

精密吸取15.5 μg/mL的对照品溶液10 µl，重复进样5次，按照“2.1”项下色谱条件，记录峰面积，计算相对标准偏差，RSD为1.01%＜2%，精密度符合要求，仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一腺苷对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，在0、2、4、6、8、10小时注入高效液相色谱仪，记录其峰面积，计算相对标准偏差，RSD为1.66%＜2%。对照品溶液在10小时内稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取同一批生附片粉末约2.0 g，各5份，分别按照前述供试品溶液制备方法进行样品溶液的制备，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算相对标准偏差，RSD为2.53%＜5%，表明拟定的方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的同一批生附片粗粉9份，各1.0 g，精密称定，分别精密加入一定量的对照品储备溶液（155 μg/mL），按“2.3”项方法制备供试品溶液。按“2.1”项所述色谱条件测定，计算回收率，结果见表2。

表2 腺苷加样回收率

2.10 样品的测定

取生附片、黑顺片、白附片及川乌药材粗粉约2.0 g，精密称定，照“2.3”项下方法制备样品溶液，参附注射液（每1 mL相当于含生药附子0.2 g）直接注入高效液相色谱。以上样品均在“2.1”色谱条件下测定，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 试验中依次对流动相、提取溶剂、提取方法、提取时间、提取溶剂用量等因素进行了考察。腺苷相对其他成分分离度好、干扰少，专属性及重现性高，结果准确可靠，可用于附子及其炮制品、川乌、参附注射液的质量控制和分析。

3.2 生附片中腺苷含量最高，川乌、参附注射液中次之，白附片与黑顺片几乎没有检出腺苷，主要是由于附子在炮制过程中经过胆巴水浸制、煮、水漂后，腺苷随炮制过程流失严重，并且其本身含量在生附片也较低，因此难以检出也在情理之中。

3.3 据文献报道[3,4]，黑顺片和白附片中生物总碱的含量较附片和川乌中生物总碱含量低，说明炮制过程对附子中化学成分有一定的影响。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部) [S]. 北京:中国医药科技出版社, 2010.

[2] 阴键, 郭力弓. 中药现代研究与临床应用 [M]. 北京:学苑出版社, 1993:391.

[3] 叶定江,原思通. 中药炮制学辞典 [M].上海:上海科学技术出版社, 2005:274.

[4] 王瑞,刘芳,孙毅坤,等. 不同附子炮制品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量的HPLC测定 [J]. 药物分析杂志, 2006, 26(10):1361.

（责任编辑: 胡慧玲）

Determination of Adenosine in different Aconiti Lateralis Radix Praeparata, Aconiti Radix and Shenfu Injection by HPLC

HE Cheng-jun, GENG Zhao, ZHOU Qin-mei, LI Xiao-hong, PENG Cheng, GUO Li//(Pharmacy College,Chengdu
University of Traditional Chinese Medicine;The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine;State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China)

Objective:The study was aimed to establish a HPLC method for the determination of Adenosine which was isolated from the Aconiti Lateralis Radix for the frst time in different processed products of Aconiti Lateralis Radix Praeparata, Aconiti Radix and Shenfu Injection.Method:The separation of the determination was achieve on a Diamonsil Cl8column (250 mm×4.6 mm，5 μm). The mobile phase was MeOH-phosphate buffer (15:85) at a fow-rate of 1.0 mL．min-1. The detector was set at UV 260 nm.Result:The method had a good linear relationship in the range from 0.062 μg to 0.217 μg (R=0.9997). The average recovery was 99.9% and RSD was 2.41%.Conclusion:The method is reliable, stable, simple and can be used to evaluate the quality of different processed products of Aconiti Lateralis Radix Praeparata, Aconiti Radix and Shenfu Injection.

Aconiti Lateralis Radix Praeparat; adenosine; determination

R 282.71

A

1674-926X(2014)01-004-03

“十二五”国家科技支撑计划课题(No. 2010BAE00406)

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

何成军（1989- ），男，在读硕士研究生，从事中药质量标准化研究Tel:13699449413 Email:heye1217@163.com

彭成（1964- ），男，教授，博士生导师，从事疾病动物模型与中药药理毒理研究Email:pengchengchengdu@126.com

2013-06-08