中国人群中动脉硬化性脑小血管病易感基因及预测模型的研究

李伟，胡波，李桂林，张在强，王拥军

脑小血管病是最常见中老年、隐性、进展性脑血管病，它是导致血管性痴呆最重要的一个原因。动脉硬化是脑小血管病最常见病因。目前脑小血管病的研究，除了对环境因素和危险因素（高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、老龄等）的研究外，遗传背景因素是脑小血管病致病机制的重要内容，它作为一种复杂性状性疾病具备了多基因易感性的特点[1-3]。虽然现有的研究结果不尽人意，但根据全基因组卒中研究（genomewide association studies of stroke，GWAS）[4-6]，

结合脑小血管病的病理生理，病理学变化结果提示——脑小血管病的易感基因选择可以涉及以下几个方面：①脂代谢调节通路[7]；②炎性及Rho相关通路[8-9]；③血脑屏障细胞间连接调节通路[10-11]；④小血管病病理表现胶原纤维高表达的调节通路[12]。本研究旨在探讨动脉硬化性脑小血管病与候选易感基因相关性，构建脑小血管病的预测模型，为脑小血管病致病机制和预防提供重要的基因背景证据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 研究对象来自首都医科大学附属北京天坛医院门诊、住院部、脑血管病筛查门诊及体检门诊，连续收集脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）样本存入北京天坛医院脑血管病基因库。从2009年6月～2013年12月天坛医院脑血管病基因库样本中随机选出脑小血管病患者197例，大动脉粥样硬化性脑血管病（血管狭窄率＞50%）患者198例，高血压性脑出血患者200例，非卒中对照197例，共计792例。

脑小血管病入组标准[13]：符合脑小血管病磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRⅠ）或计算机断层扫描（computed tomography，CT）影像学特点：①脑缺血性脱髓鞘改变；②腔隙性脑梗死；③血管周围间隙扩大；④脑内微出血。并排除：①有穿支动脉的父动脉和供血动脉粥样硬化性狭窄或闭塞（大、中动脉＞50%的狭窄）证据的患者；②有心源性栓塞证据的患者；③有多发性硬化，血管炎，一氧化碳中毒及农药中毒性脱髓鞘，遗传性白质脑病，代谢性白质脑病，化疗，放疗相关性脑白质病证据的患者；④有动脉夹层、肌纤维营养不良、烟雾病等大血管病变证据的患者；⑤拒绝参加本项研究患者。

大动脉粥样硬化性脑血管病入组标准[13]：①支持动脉粥样硬化性指标［颈动脉内膜中层厚度（intima-media thickness，ⅠMT）＞1.5 mm］；②颈动脉血管超声和经颅多普勒检查提示颈部动脉或颅内动脉狭窄率＞50%，或血管影像学检查提示颈部动脉或颅内动脉狭窄率＞50%；③影像学提示相应责任大动脉供血区表现分水岭梗死，或皮层、小脑、脑干及皮层下梗死病灶直径＞1.5 cm脑梗死；④临床表现为非腔隙综合征表现。排除标准：①心源性栓塞患者；②脑小血管病患者，或皮层下梗死及脑干梗死病灶直径＜1.5 cm的患者；③有动脉夹层、肌纤维营养不良、烟雾病证据的患者；④拒绝参加本项研究患者。

高血压性脑出血入组标准：明确的高血压病史，影像学提示基底节区出血性改变，并排除动脉瘤，药物相关性出血及血液系统疾病。

非卒中对照组入组标准：①MRⅠ或CT等影像学检查没有任何类型脑血管病表现；②没有卒中或短暂性脑缺血发作病史；③无脑血管病相应症状和体征。

对脑小血管病、大动脉粥样硬化（血管狭窄率＞50%）及高血压性脑出血病例，进行病史采集，入院后测双侧肱动脉血压，血生化检查（包括血常规，血脂，空腹血糖，血肌苷，血尿素氮，超敏C反应蛋白，血浆同型半胱氨酸，红细胞沉降率）；对脑小血管患者还进行了抗中性粒细胞抗体，心磷脂抗体，抗核抗体/免疫全套，糖化血红蛋白检测。所有研究对象都进行了头影像学及相应的血管影像学检查，需要鉴别心源性卒中患者均进行了超声心动图检查，24 h动态心电监测或多次心电图检查。

本项研究通过了伦理委员会医学伦理批准，研究对象知情同意并签署了知情同意书。

1.2 候选基因单核苷酸多态性的选择 候选基因选择经过两个步骤：第一，根据文献中报道的热门单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP），以及美国国家生物技术信息中心（National in BiotechnologyⅠnformation，NCBⅠ）中频率较高的错义SNP（插入与缺失＞15%）和影响基因表达的调控5’端tag SNP；第二，根据第一次的选择位点结合统计学分析结果，在位点P值＜0.01所对应的基因中，通过文献及其基因功能的复习，重新遴选SNP位点。第一步骤共选择19个基因55个SNP位点；第二步骤易感基因候选出4个基因，包括神经损伤诱导蛋白2（nerve injury induced protein 2，NⅠNJ2）、水通道蛋白4（Aquapofins 4，AQP4）、细胞周期依赖性激酶抑制基因2A（inhibitor of cdk 4/alternative reading frame，ⅠNK4/ARF）、肌球蛋白轻链激酶基因（myosin light chain kinase，MYLK），15个SNP位点（表1）。

1.3 单核苷酸多态性检测 抽取患者的静脉血5 ml（肝素抗凝），小量全血基因组DNA快速提取试剂盒提取全血DNA（北京博迈德科技发展有限公司）。利用SNaPshot SNP分型技术对样本进行SNP位点分型检测。设计51对聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物用于扩增包含55个SNP位点的51个118～338 bp片段，也设计了55个紧邻SNP位点的延伸引物用于单碱基延伸。引物设计用在线Primer 3软件。PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得，PCR产物经虾碱性磷酸酶（Promega公司）和外切酶Ⅰ（Epicentre公司）纯化后，SNaPshot多重试剂盒进行延伸反应（ABⅠ公司）。延伸产物用虾碱性磷酸酶纯化后，在基因测序仪（ABⅠ3130xl，ABⅠ公司）上样。SNP分型用基因分型软件GeneMapper 4.0（Applied biosystems）分析。以上试验由上海天昊生物有限公司协助完成。

1.4 统计方法 经过年龄和性别校正后，SNP位点在5种遗传模型下（共显性模型、显性模型、隐性模型、超显性模型、叠加模型）用SAS分析软件进行相关性分析。应用阿凯克信息准则（The Akaike Ⅰnformation Criterion，AⅠC）计算各遗传模型，选择最小AⅠC值的遗传模型。应用permutation多重检验进行校正。数量变量应用t检验，计数变量使用χ2检验，相关性分析采用Logistic回归分析。本试验采用SAS统计件软Logistic模块进行预测模型的分析，应用基尼指数（GⅠNⅠ）表现其效果。

表1 脑小血管病候选4个基因及15个单核苷酸多态性位点

2 结果

研究对象平均年龄为（58.05±11.5）岁。危险因素分析经过年龄、性别校正后，可见糖尿病比例分别是动脉粥样硬化性脑大血管病40.26%，脑小血管病29.53%，高血压性脑出血19.29%，各组之间存在显著性差异（P＜0.001）；高血压脑出血组与脑小血管病组比较（P=0.02），大动脉粥样硬化组与脑小血管病组比较（P=0.02）。高脂血症和吸烟发生率在各组间也有显著差异（P＜0.001和P=0.002），在大动脉粥样硬化组发生率最高，两两比较显示，大动脉粥样硬化组高脂血症发生率显著高于高血压脑出血组（P=0.001）和脑小血管病组（P=0.001）；大动脉粥样硬化组吸烟率显著高于高血压脑出血组（P=0.003）和脑小血管病组（P=0.001）（表2）。

AⅠC值最小的SNP位点的遗传模式是超显性模型（overdominant model）（图1）。脑小血管病与非卒中对照组个体差异性检验，MYLK基因rs2222823杂合子（A/T）的优势比（odds ratio，OR）为0.52，95%可信区间（conf i dence interval，CⅠ）为（0.35～0.79），P=0.002，校正P=0.031）；ⅠNK4/ARF基因rs2811712杂合子（C/T）的OR值为1.75［95%CⅠ（1.13～2.71），P=0.004，校正P=0.050］（表3，图2）。脑小血管病与高血压性脑出血患者差异性检验，rs2222823位点的P值为0.035。在脑小血管病与动脉硬化性脑大血管病患者差异性检验中，非糖尿病患者及饮酒患者在rs2222823位点P值分别为0.012和0.018；高脂血症及饮酒患者在rs2811712位点P值分别为0.029和0.04。依据易感基因构建脑小血管的预测模型的GⅠNⅠ值为0.442。

3 讨论

本研究表明MYLK基因和ⅠNK4/ARF基因的两个SNP位点，rs2222823和rs2811712，与脑小血管疾病显著相关。SNP位点rs2222823位于MYLK基因启动子的tagSNPs的区域，rs2811712位与ⅠNK4/ARF基因的5’端区域，均位于这两个基因的重要功能结构区域，具有决定基因功能的重要意义，因此提示脑小血管病与MYLK基因和ⅠNK4/ARF基因密切相关。在SNP位点rs2222823（MYLK基因）杂合基因型（T/A）对脑小血管疾病有保护作用，而在位点SNP rs2811712杂合基因型（C/T）对脑小血管病有促进作用。

图1 不同遗传模型下AIC值的比较注：*：rs2811712；**：rs2222823；AIC：阿凯克信息准则

表2 研究对象的基本信息情况

表3 性别和年龄校正后脑小血管病与非卒中对照在超显性遗传模式下相关性分析

图2 rs2222823与rs2811712不同基因型的OR值情况注：OR：优势比

2007年Wang等[14]研究发现MYLK基因与动脉粥样硬化疾病相关。2009年Su等[15]研究发现激活的肌球蛋白轻链激酶具有增强血管内皮通透性的作用[16]。最近多个研究发现ⅠNK4/ARF基因与衰老[17-18]和老年疾病如心肌梗死、卒中、2型糖尿病密切关联[19-20]。动脉硬化性脑小血管病为一种动脉硬化微血管病变，其中血-脑屏障通透性增加是其重要的病理生理变化。因此，这些研究均提示MYLK和ⅠNK4/ARF基因与血脑屏障功能障碍和动脉硬化有关。Burton等研究者多项研究表明ⅠNK4/ARF基因SNP位点rs1333049区域与冠状动脉粥样硬化性心脏病和卒中密切相关[21-23]。而本研究结果显示NK4/ARF基因rs2811712位点与脑小血管病的卒中亚型有关，这可能是由于种族差异导致的不同的SNP位点结果。但同样说明在染色体9p21.3区域的ⅠNK4/ARF基因与卒中相关，很可能与脑小血管病有关。在5种遗传模型基因型分析中AⅠC值最低的是超显性模型。虽然在卒中很少观察由于超显性模型易致病性的报道，但许多研究中发现了超显性遗传模式与疾病相关[24]，如癌症的一些研究中表明，在超显性模型下某些基因的多态性与癌症密切相关[25-26]。因此，将来需要深入研究在超显性遗传模型下脑小血管病易感基因的作用。

在理论上可能导致这种杂合子偏倚的原因有以下几种情况：从技术上讲，可以是由使用不准确的限制性内切酶造成的，而本试验应用的基因分型技术不会造成这种情况。从分子学角度，它可能是具有非常强大的主导性的变异等位基因，使杂合子具有等同于纯合子效果。在统计学角度，由于变异纯合子在病例和对照组相对样本较少，变异纯合子比较杂合子的效果可能会存在选择性偏倚，简单的说，就是统计力度不够，不能反映变异纯合子的真实效果，只能通过更大的研究样本予以纠正。在预测模型评估方面，模型预测效果可以用GⅠNⅠ值来衡量，GⅠNⅠ越接近1，说明模型的表现越好，而本研究GⅠNⅠ值偏低，并且由于没有大样本来验证这些结果，模型的表现可能非常不稳定。所以单纯应用基因型预测复杂性状性疾病的预测模型具有很大局限性，也就是说，复杂性状性疾病预测模型构建除涵盖易感基因外，还需要增加危险因素等因子才能增强预测模型的力度。另外，本研究样本例数相对较小，下一步仍需要更大样本量验证这两个SNP位点与脑小血管病的关系。

总之，MYLK和ⅠNK4/ARF基因与中国人群中动脉硬化性脑小血管病有显著相关性，MYLK基因rs2222823杂合子（A/T）有减缓脑小血管病患病率作用，而ⅠNK4/ARF基因rs2811712杂合子（C/T）对脑小血管病的患病率具有促进作用。预测模型需要增加更多的变量来加大模型的效度。

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