大剂量高压氧超早期治疗对局部脑梗死大鼠细胞凋亡的影响

于秋红，李婕，刘亚玲，郁军超，薛连璧

神经保护是脑梗死的治疗策略之一，也是脑血管病领域的研究热点之一。有研究提示高压氧（hyperbaric oxygenation，HBO）治疗能促进脑血管侧支循环建立[1]，且有直接神经保护作用，可保护缺血半暗带休眠脑细胞[2]。我们前期实验[3]提示大剂量HBO超早期治疗永久性大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠，可能在抑制、阻断，甚至逆转其脑缺血后病理变化方面具有一定的作用，通过提高内源性血管内皮因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促进侧支循环建立，减小脑梗死体积可能是其机制之一。有研究[4]显示高压氧可以通过抑制一氧化碳中毒大鼠海马神经细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）降低来影响细胞凋亡，但对脑梗死大鼠是否具有同样作用，目前尚无研究。基于此，我们采用HBO单次9 h方案治疗超早期局部脑梗死大鼠，观察HBO对细胞凋亡和膜电位的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠72只，重量（280±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验前大鼠禁食不禁水3 h以上。

1.2 试剂 北京化学试剂公司生产水合氯醛、2，3，5苯四氮唑（tetrazolium chloride，TTC）、蔗糖，南京凯基生物科技发展有限公司出品多聚甲醛（Cat#KGT558）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS，Cat#KGT549）、柠檬酸钠（Cat#KGT553）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，Cat#KGT551）、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）试剂盒（Cat#KGA7044，含缓冲液、荧光素标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸、脱氧核糖核苷酸末端转移酶、抗荧光素抗体、辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺显色剂）、细胞悬液制备试剂盒（Cat#KGA829）、罗丹明123染色试剂盒（Cat#KGA217）。

1.2 模型制作及分组 采用改良的Zea-longa线栓法[5]制作大鼠永久性MCAO模型，选择阻塞左侧大脑中动脉，模型制作后3 h采用姿势反射实验对大鼠进行行为学评分（3分制）[6]，评分≥1分的动物视为造模成功，排除麻醉未清醒、死亡、无自主行动大鼠和无神经功能缺损大鼠，造模成功的大鼠随机分为对照组（n=36）和HBO组（n=36）。

1.3 实验方法 采用上海减压器厂生产的透明纯氧动物实验舱。HBO组动物于MCAO后3 h内开始HBO。治疗压力为0.2 MPa。升压20 min，稳压9 h，减压40 min。为避免氧中毒，大鼠分别于1 h、3 h、5 h、7 h、9 h呼吸纯氧，2 h、4 h、6 h、8 h呼吸舱内高压空气。对照组大鼠于MCAO后，呼吸常压空气。

1.4 观察指标 ①神经功能评分：采用Garcia评分标准[7]在MCAO后3 h、13 h、72 h对大鼠行为学进行评价。②脑梗死体积：大鼠于缺血后13 h、72 h断头取脑，各时间点每组取6只大鼠，全脑于冷冻状态下切成5片，每片冠状切片厚度2 mm。对脑组织进行TTC染色后测定各组脑梗死体积，正常脑组织染成粉红或紫红色，梗死灶染成白色。用ⅠmageJ软件对每只大鼠脑组织梗死面积、半球面积进行定量测定，为除去梗死部位组织水肿带来的误差，采用校正的梗死面积测定公式，即梗死面积=右侧半球面积－（左侧半球面积－测定的左侧半球梗死面积）[8]。梗死容积=Σ（相邻两片脑组织梗死面积相加×1/2×层厚）。考虑到不同体重大鼠的脑组织的基线重量不同，所以计算相对梗死容积，即梗死容积占大脑总容积的百分比[8]。③凋亡细胞数：于模型制成后13 h、72 h取材，每组取6只大鼠麻醉，生理盐水、4%甲醛灌注，取前囟后3～6 mm处脑组织冷冻切片后行TUNEL染色，按TUNEL染色说明书操作，将厚度为20 μm冷冻切片浸入通透液，冰上促渗2 min，PBS冲洗3次，滴加脱氧核糖核苷酸末端转移酶反应液，置于湿盒中37℃反应60 min，PBS冲洗3次后荧光显微镜观察，各组均可见标记为绿色荧光的TUNEL阳性细胞，各样本随机选取5个缺血半暗带视野观察，计数视野中的阳性细胞数，取平均数。④线粒体膜电位：大鼠于缺血后13 h、72 h断头取脑，每组各时间点取6只大鼠，将缺血半暗带脑组织[9]剪成糊糜，加入消化酶A消化25 min，经过漂洗、吹打、研磨、过滤、离心制成细胞悬液，加入罗丹明123染液，按说明书操作，孵育、离心、重悬细胞培养、离心、再重悬，流式细胞仪检测罗丹明123荧光强度以观察膜电位变化情况，激发波长488～505 nm，发射波长515～575 nm。荧光值越高，表示线粒体跨膜电位越低，反映线粒体功能越差，正常值为1067.96。

1.5 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料符合正态分布，以s表示，同组间不同时间点比较采用相关样本t检验，两组比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为有显著差异。

2 结果

对照组大鼠死亡7只，13 h内2只，13～24 h、24～48 h、48～72 h内分别死亡1只、2只和2只，经解剖证实死因分别为脑出血、脑水肿和蛛网膜下腔出血，剔除数据后重新补充模型。HBO组治疗过程中无死亡、癫痫发生。

2.1 神经功能评分 两组各时间点Garcia评分比较见表1。由表1可见，与3 h相比，各组大鼠在MCAO 13 h时神经功能较MCAO 3 h时即有明显改善（P均=0.007），72 h时改善有更明显的趋势（P均＜0.001），但72 h时与13 h时比无显著差异。各时间点对照组与HBO组相比，神经功能无显著差异。

2.2 脑梗死容积 可以观察到梗死灶主要位于左侧MCA分布区的皮层、皮层下白质和基底节区。各组脑梗死容积比符合正态分布，对照组13 h、72 h时梗死容积百分比分别为（15±5.2）%、（28±5.3）%，HBO组大鼠13 h、72 h时梗死容积比分别为（11±3.0）%、（15±7.3）%，缺血13 h时两组大鼠脑梗死容积比无显著差异，72 h时对照组脑梗死容积比较13 h时增大（P=0.02），HBO组脑梗死容积比较对照组小，差异有显著性（P=0.02）。

2.3 凋亡细胞数 缺血半暗带区可见大量凋亡细胞，13 h时凋亡细胞数HBO组较对照组少，差异有显著性（P=0.04），72 h时两组的凋亡细胞数无显著差异（P=0.92）。对照组72 h时凋亡细胞数少于13 h时，差异有显著性（P=0.03），HBO组72 h时与13 h时无显著差异（P=0.47），详见表2。

2.4 线粒体膜电位 从MCAO后13 h开始，对照组荧光值升高，提示线粒体膜电位下降，至72 h无明显变化（P=0.76）。HBO组荧光值相对稳定于较低水平，提示线粒体膜电位稳定于较高水平，72 h与13 h比，无显著差异（P=0.58）。对照组各时间点膜电位均低于HBO组（P＜0.001）（表3）。

表1 各组大鼠Garcia评分比较

3 讨论

目前的动物实验显示HBO治疗永久性脑动脉阻塞模型结论存在争议，HBO时间窗和剂量是疗效差异的关键。有文献表明，幕上非腔隙性梗死的病理演变时间是6～18 h，平均约10 h[10]。基于上述理论，我们采用9 h HBO在3 h内开始治疗永久性MCAO大鼠，力求阻止，甚至逆转卒中的病理演变过程。本研究和前期结果[3，11]类似，显示了单次9 h HBO能改善局部脑梗死大鼠神经功能，缩小脑梗死容积。缺血周围区存在部分休眠细胞，及时供氧可能挽救其功能，反之，则发生细胞凋亡或坏死。细胞凋亡是个主动耗能过程，需要三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）供能，ATP的缺乏将直接阻断凋亡通路，使细胞转向坏死[12-13]，进而扩大梗死容积。ATP的主要来源是线粒体，从理论上讲，如果能促进线粒体产生ATP，则可减少细胞坏死，缩小梗死容积。线粒体膜电位是线粒体进行氧化磷酸化产生ATP的先决条件，膜电位下降，标志着细胞不可逆损伤的开始[14]。李强等[15]发现缺血后脑组织线粒体存在短暂的内源性代偿修复机制，但不足以逆转氧化应激对线粒体的持续损伤。Li等[13]应用培养的海马细胞证实减少氧自由基聚集，可以抑制膜电位的降低，从而抑制细胞坏死。一方面，HBO提高梗死周围组织氧供[16]，增加线粒体的ATP含量，从而减少细胞坏死，减轻组织损伤，另一方面又产生氧自由基，对膜电位到底有何影响，目前的研究尚未得出结论。

表2 各组凋亡细胞计数比较（个）

表3 各组线粒体的罗丹明123荧光强度比较

本研究结果显示大剂量HBO后，膜电位持续稳定于较高水平，缺血半暗带区凋亡细胞数在13 h降低，考虑HBO提供了充足的氧供，挽救了休眠细胞，所以凋亡细胞数减少。而72 h后，两组凋亡细胞几近相等，推测原因：一是MCAO后部分细胞坏死，故而凋亡数量减少，二是HBO持续作用时间有限，未能覆盖缺血灶病理生理变化的全过程。本研究中HBO组大鼠72 h时脑梗死体积与13 h无显著性差异，提示细胞发生凋亡，所以梗死体积变化不大，而对照组72 h时梗死体积较13 h明显扩大，考虑此阶段细胞坏死，故而梗死体积扩大，这与本研究凋亡细胞数及线粒体膜电位的变化趋势也是相符的，提示缺血超早期提供充足氧供，减少细胞凋亡，有助于缩小梗死容积，通过线粒体途径影响细胞凋亡，可能是HBO的机制之一。本课题组以前的研究[17]发现，虽然9 h HBO可能增加了脑组织中某些自由基的含量，但不仅没有加重过氧化损伤水平，反而显著降低了实验大鼠脑组织的过氧化损伤程度，可能是HBO产生的神经保护作用比自由基产生的损伤作用更强大。

此外，还有其他体内体外的研究证实HBO可以通过线粒体途径影响细胞凋亡。Weber等[18]将T细胞暴露于高压氧气中，发现1次30 min的HBO暴露即可通过线粒体机制引起淋巴细胞凋亡。而Bai等[19]则认为HBO治疗早期急性胰腺炎大鼠，正是通过线粒体途径引起外周血淋巴细胞凋亡，抑制了炎性反应，从而降低了大鼠胰腺炎的程度。其机制包括凋亡诱导因子[13]转位、神经蛋白[20]等，有关机制本课题组亦将继续研究。

本研究尚存以下局限：①观察点较少，观察时间短，可能不足以反映脑梗死过程中各指标的演变过程；②样本量小；③由于缺血半暗带是一个动态变化的区域，故取材定位的缺血半暗带与实际的缺血半暗带可能存在差距。

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