柔红霉素对HL-60敏感细胞miRNA-21等5种miRNA表达的影响
2014-03-08燕华,李卫
燕 华,李 卫
(1.河南省郑州市儿童医院血液科 450053;2.广西医科大学科学实验中心,南宁530021)
急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是急性髓系白血病(AML)的一种特殊类型,染色体异位t(15;17)和(PML/RARa)融合基因阳性是其惟一的形态学特征,约占AML的10%~15%,临床特征易导致弥散性血管内凝血(DIC)[1]。柔红霉素(DNR)可与DNA结合,并抑制核酸的生物合成,是目前治疗AML的主要化疗药物之一。尽管目前通过DNR、维甲酸等治疗已经可以使初治患者的完全缓解率大幅度增加,但仍有部分患者由于病情复发而死亡,其中原因之一就是白血病细胞对化疗药物产生耐药。耐药性的产生是由多种机制作用而产生的,其中主要包括ATP依赖的能量泵活性增强使细胞内药物外排增加、拓扑异构酶Ⅱ表达改变使增加肿瘤细胞DNA损伤的修复能力增强以及肿瘤细胞凋亡减少而产生的耐药性等[2-4]。耐药基因主要包括多药耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白基因(MRP)、肺耐药蛋白基因(LRP)、乳腺癌耐药蛋白基因(BCRP)等。目前,随着miRNA研究的不断深入,越来越多的研究发现miRNA与白血病及其耐药方面存在密切的联系。
miRNA是一类长度为19~25个核苷酸,非编码的RNAs,广泛存在于真核生物中,在后转录水平调控mRNA的表达[5]。现已发现,miRNA参与许多生物学过程,例如细胞增殖,分化和凋亡等,人类大约30%的基因受到miRNA的调节[6-7]。近年来,miRNA与胃癌、乳腺癌、卵巢癌等相关的多药耐药miRNA相继报道,在白血病多药耐药方面也引起了越来越多的关注。目前,在其他肿瘤中已经发现miRNA-21、miRNA-125b、miRNA-181d、miRNA-27a和let-7f等5种 miRNA可能与耐药相关,但关于他们在HL-60细胞中的表达及DNR对他们的影响鲜有报道,因此,本研究采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测这5种miRNA在HL-60中的表达情况,并探讨DNR对这些表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 人APL药物敏感细胞HL-60购自武汉博士德公司。人APL耐药细胞HL-60/A购自中国医学科学院血液学研究所,该细胞可在500ng/mL的阿霉素培养液中稳定生长。
1.2 主要试剂 RPMI1640培养基购自Hyclong公司,国产四季青胎牛血清(FBS),浙江海正药业有限公司的盐酸DNR,Small RNA提取试剂购于TaKaRa公司的RNAiso for small RNA。逆转录PCR和RT-PCR试剂盒购自Gene CopoeiaTM公司。噻唑蓝(MTT)美国Sigma公司产品,实验前现配5mg/mL溶液。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 取对数生长期的HL-60和HL-60/A置于RPMI1640培养液中(100mL里含有10mL FBS),于37℃、50mL/L CO2饱和湿度的培养箱中稳定生长。细胞悬浮生长,正常情况2~3d更换1次新鲜培养基。HL-60/A以500 ng/mL的DNR维持耐药表型。
1.3.2 实验分组 分为实验组、对照组1和对照组2。其中实验组以小剂量(10ng/mL)的DNR持续作用于HL-60敏感细胞,并于用药后第1、7、14和28天检测细胞的抑制率及miRNA的表达。对照组1和2分别是HL-60/A耐药细胞和不接受DNR持续作用的HL-60敏感细胞。对照组1要以500 ng/mL的DNR维持其耐药表型。
1.3.3 四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测小剂量DNR持续作用对HL-60细胞的抑制率 用10ng/mL的DNR持续作用于HL-60DNR敏感细胞,然后分别在DNR作用后的第1、3、5、7、10和14天取等量的细胞做MTT实验。按照上述实验方法,调整细胞密度,每孔取200μL接种于96孔培养板中,其中实验组分别加入4、8和16ng/mL的DNR,对照组1加入与实验组最大DNR用量等体积的生理盐水,对照组2只含有培养基无细胞,每组设6个孔培养。培养箱中培养48h后加入MTT 20μL,继续培养4h后2 000r/min离心10min,小心吸去上清液,每孔再分别加入150μL的二甲基亚砜(DMSO),振荡至MTT完全溶解,用酶标仪测各孔490nm波长的吸光度(A)值,绘制小剂量DNR作用不同时间后对HL-60细胞的抑制率曲线。
1.3.4 microRNA的提取和逆转录 按说明用TaKaRa公司的RNAiso for small RNA试剂盒分别提取各实验组及对照组的miRNA,用紫外分光光度计测A260和A280,计算浓度,并用15g/L的琼脂糖凝胶跑电泳检测miRNA的完整性。采用逆转录试剂盒将miRNA逆转录为cDNA,在25μL逆转录体系中含有5×RT Buffer、miRNA模板300ng、2.5UPoly A Polymerase和RTase Mix 1μL。反应条件为37℃60min,85℃5min。所得的逆转录产物用灭菌水稀释10倍进行下一步PCR实验。
1.3.5 RT-PCR检测miRNA的表达 RT-PCR的下游引物为ALL-in-oneTM miRNA RT-PCR试剂盒提供的通用引物(Universal adaptor PCR Primer),上游引物用 Primer Premier 5.0软件按照引物设计原则进行设计,并由上海生工合成。miR-181d上游:5′-GCG GGA ACA TTC ATT GTT GT-3′;miR-125b上游:5′-GCT CCC TGA GAC CCT AAC TTG-3′;let-7f上游:5′-GGG GGT GAG GTA GTA GAT TGT AT-3′;miR-27a上游:5′-GGA GGG CTT AGC TGC TTG TGA-3′;内参U6和miRNA-21的上下游引物由ALL-in-oneTM miRNA RT-PCR试剂盒提供。20μL PCR反应体系中含有2×ALL-in-one Qpcr Mix,PCR Forward Primer(2μmol/L)1.5 μL,Universal Adaptor PCR Primer(2μmol/L)1.5μL,10倍稀释的cDNA模板4.0μL和50×ROX Reference Dyeiv 0.2 μL。PCR反应条件为:95预变性10min。95℃变性10s,60℃退火40s,72℃延伸40s,重复40个循环。各样本均重复3孔,以平均CT值(阈值循环数)作为每个样本的CT值。并以U6为内参,采用相对定量2-△△CT法进行miRNA相对定量的比较。样品目的基因的相对表达用2-△△CT方法计算,即Fold change=2-△△CT=2-[待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值]-[对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值]。
1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料以±s表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 小剂量DNR持续作用对HL-60敏感细胞的抑制率 以10ng/mL的DNR持续作用于HL-60细胞,然后于用药后第1、3、5、7、10和14天,再分别以4、8和16ng/mL等3种浓度的DNR做48h的MTT实验,观察DNR对细胞增殖的抑制率,见表1。随着DNR作用时间的延长,各浓度的抑制率逐渐减小,且在加药的第10天左右,逐渐进入1个平台期,表明随着小剂量DNR的持续作用,HL-60敏感细胞可能在用药后的第10天左右逐渐对DNR产生耐药,见图1。
表1 小剂量DNR持续作用对HL-60敏感细胞的抑制率(±s,%)
表1 小剂量DNR持续作用对HL-60敏感细胞的抑制率(±s,%)
浓度(ng/mL) 加药第1天 加药第3天 加药第5天 加药第7天 加药第10天 加药第14天4 18.60±1.15 15.40±1.12 9.50±0.97 7.50±1.184.40±0.25 3.20±0.93 8 26.70±3.19 16.60±1.22 13.70±0.85 11.50±1.20 6.90±0.93 7.60±0.75 16 33.80±3.17 27.60±2.58 16.50±2.06 14.90±1.19 9.60±1.00 10.90±1.04
图1 DNR作用miRNA-21表达的RT-PCR检测结果
图2 DNR作用miRNA-125b表达的RT-PCR检测结果
图3 DNR作用miRNA-181d表达RT-PCR检测结果
图4 DNR作用let-7f表达的RT-PCR检测结果
图5 DNR作用miRNA-27a表达的RT-PCR检测结果
2.2 miRNA RT-PCR检测结果 RT-PCR检测结果发现,与对照2组比较,miRNA-21和miRNA-125b在对照1组中的表达显著上调(P<0.05),实验组细胞则从加药的第7天起表达上调(P<0.05);相反,miRNA-181d、miRNA-27a、let-7f在对照1组中的表达下调(P<0.05),而在实验组细胞中则是在加药后的第7天开始下调(P<0.05),见图1~5。
3 讨 论
抗癌药物的耐药性因人而异,原因很多,其中miRNA也是一个重要的影响因素之一。miRNA的调控是一个复杂的过程,一种miRNA可以作用于多个靶基因,而一个靶基因也可以受多种miRNA调控。在多种人类癌症中已经发现miRNA-21表达上调。Wang等[8]研究发现,上调miRNA-21在 MCR-7/ADR细胞中的表达可导致PTEN蛋白下调,miRNA-21的模拟物和抑制物明显影响乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。转染了抗miRNA-21寡核苷酸(anti-miRNA-21oligonucleotide,AMO-miRNA-21)的细胞可增加HL-60细胞对Ara-C的敏感性,并证实AMO-miRNA-21的作用可能是通过上调PDCD4来实现[9]。随后在耐DNR的K562白血病耐药细胞中发现miRNA-21明显上调,并通过实验证实miRNA-21可以调节PTEN的表达,影响PI3K/AKt通路,从而起到调节K562细胞对DNR的耐药性[10]。Zhu等[11]通过对比多药耐药细胞和亲本细胞,证实miRNA-125b和miRNA-27a在人类耐药的卵巢癌细胞和子宫颈癌细胞中表达上调。Zhang等[12]发现,miRNA-125b在儿童APL细胞中高表达,并且进一步证实miRNA-125b可以通过调节肿瘤抑制基因Bak1的表达来促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。研究还发现,miRNA-125b在HL-60/DOX、K562/DOX、NB4-R1和 NB4-R2这4种白血病耐药细胞中表达上调。这些研究均表明miRNA-21和miRNA-125b可能与肿瘤的耐药相关。本研究首先使用低浓度DNR药物作用于HL-60敏感细胞,然后于用药后的第1、3、5、7、10和14天用不同浓度的DNR测试细胞的MTT反应,结果发现随着小剂量DNR持续作用时间的延长,DNR对于HL-60细胞增殖的抑制率逐渐减小,并在用药后的第10天左右逐渐进入平台期,提示HL-60敏感细胞可能在小剂量DNR持续作用10d左右开始产生耐药。同时,笔者采用RT-PCR检测DNR不同作用时间HL-60敏感细胞中miRNA-21、miRNA-181d、miRNA-125b、let-7f和miRNA-27a5种miRNA的表达,结果发现HL-60/A耐药细胞中的miRNA-21和miRNA-125b表达明显上调,而敏感细胞的miRNA-21和miRNA-125b表达也在小剂量DNR作用后的第7天起出现显著上调,提示miRNA-21和miRNA-125b的表达上调可能与HL-60对DNR产生耐药性有关。
Eric等[13]利用miRNA微阵列技术发现慢性髓细胞白血病细胞敏感株MYL与耐伊马替尼耐药株MYL-R大约有30种miRNA的表达出现超过2倍以上的差异。其中miRNA181(a~d)家族在耐药细胞株中明显下调。本研究发现,miRNA-181d在HL-60/A耐药细胞中表达下调,而敏感细胞则在用药后的第7天起出现下调,与上述结果一致。Feng等[14]通过实验发现在白血病细胞中miRNA27a和miRNA-331-5p与耐药基因P-gp的表达成负相关,并对K562耐药细胞和HL-60 DOX耐药细胞中分别转染miRNA27a和miRNA-331-5p,发现转染后可以增加耐药细胞对DNR药物的敏感性。Let-7最初发现是参与调节线虫发育时序,Yang等[15]的研究表明,let-7i在耐药的乳腺癌细胞中表达下调,并且减少let-7i的表达量可以明显的增加卵巢癌和乳腺癌细胞对化疗药物的抵抗性。本研究也发现,miRNA-181d、miRNA-27a和let-7f在 HL-60/A耐药细胞中的表达下调,而HL-60敏感细胞则在持续用药的第7天起表达下调,提示miRNA-181d、let-7f和miRNA27a的表达下调也可能与HL-60细胞对DNR的耐药性也具有一定的相关性。
综上所述,本研究对5种miRNA在HL-60细胞中的表达进行了探索,对这5种miRNA与HL-60细胞耐药性的相关性有了初步的认识。今后还需要通过转染miRNA特异的寡核苷酸模拟物及抑制物等手段,进一步了解这些miRNA的靶基因及其作用机制,为降低APL的耐药性,提高药物化疗效果打下理论基础。
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