过量氟引起成骨细胞内质网应激信号通路的基因差异表达*
2014-03-08张亚楼孙小娜冯树梅廖礼彬白生宾钟近洁
张亚楼,孙小娜,冯树梅,李 甜,廖礼彬,白生宾,钟近洁△
(1.新疆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室,乌鲁木齐830011;2.新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心放射卫生科,乌鲁木齐830001)
氟中毒是一种慢性全身性疾病,可致氟斑牙和氟骨症。地方性氟中毒是我国流行最为广泛、病情最为严重的重点地方病之一[1]。目前,氟中毒机制仍不清楚。研究表明染氟成骨细胞存在内质网应激[2-3]。但是对于内质网应激信号通路在染氟成骨细胞中的表达,未见报道。本研究用氟化钠(NaF)干预体外培养的人成骨肉瘤细胞Saos-2,应用荧光定量PCR Array技术和蛋白免疫印迹法(Western blot)观察对成骨细胞中未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)信号通路的差异基因蛋白表达,为揭示过量氟暴露下成骨细胞内质网应激的发生特点和开发相应的药物保护剂提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料 NaF,分析纯(上海生工);人成骨肉瘤细胞Saos-2购于上海细胞库;AnnexinⅤ凋亡检测试剂盒(Invitrogen);MTS细胞增殖分析试剂盒(Promega);RNeasy Plus Mini Kit;RT2First Strand Kit(Qiagen);RT2SYBR Green qPCR Mastermix(Qiagen);PCR 芯片(PAHS-089ZA-2)购于 Qiagen公司;实验中所用一抗BIP、XBP1、ATF4、IRE1、CHOP、EIF2S1、β-actin均购自Abcam公司,羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)二抗、羊抗鼠HRP二抗购自武汉博士德。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 Saos-2在含10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱进行贴壁培养,每2~3天根据细胞生长的密度和培养液酸碱度的变化更换培养液,当细胞汇合达度到80%进行传代培养。
1.2.2 细胞增殖 Saos-2细胞生长处于对数生长期时,胰酶消化成单细胞悬液。细胞计数后以2×104细胞接种于96孔板,37℃、5%CO2培养。NaF用培养液配制,浓度分别为5、10、20、40、80mg/L,同时设立空白对照(对照组)。染氟时间为24h。每孔100μL培养基加入20μL MTS,酶标仪检测吸光度值,检测波长490nm。每种处理剂量设置5个复孔。
1.2.3 凋亡细胞的流式细胞仪检测 将Saos-2细胞接种于25cm2的培养瓶中,待细胞长至镜下细胞融合度为80%时,加入 NaF(0、5、10、20、40、80mg/L)作用24h后,再加入0.25%胰酶消化细胞,制成单细胞悬液,调整细胞浓度为1×106个/mL,用AnnexinⅤ和PI双染色在流式细胞仪上进行早期细胞凋亡的检测。
1.2.4 PCR芯片检测 将NaF(0、10mg/L)干预Saos-2细胞24h后,提取RNA。NANODROP分光光度计测定其浓度,琼脂糖凝胶电泳测定其RNA完整性。取400ng RNA前转录合成cDNA,采用Qiagen公司RT2Profiler PCR Array进行荧光定量检测,将cDNA模板适当稀释后加入到实时荧光定量PCR(RT-PCR)反应混合液中,然后在含有基因特异性引物的96孔板各孔中加入等量反应液,于RT-PCR仪(Eppendorf Mastercycler ep realplex 2)上进行RT-PCR反应。计算每张PCR芯片中的每个基因的Ct值。每种处理组,重复用PCR芯片测定3次。采用ΔΔCt方法比较相应基因的表达量变化。表达量差异在2倍以上者为差异有意义基因。
1.2.5 蛋白表达检测 采用Western blot法。提取各组细胞总蛋白,蛋白质定量试剂盒(BCA)法测定蛋白浓度。取30μg蛋白质,与5×上样缓冲液混合,100℃变性10min。各种一抗以1∶1 000稀释。加入ECL化学发光试剂,反应5min,X线片曝光后,显影,定影,以管家基因β-actin作为内参照。
1.3 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件分析数据,细胞增殖及凋亡结果采用单因素方差(组间比较采用LSD法)分析,检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 细胞增殖结果 NaF(剂量分别为5、10、20、40、80mg/L)对人成骨细胞Saos-2作用24h后,细胞存活率分别为(100.678 5±2.830 3)%、(105.393 4±2.538 4)%、(106.125 7±2.048 4)%、(77.977 3±2.544 2)%、(30.237 7±0.632 7)%。与对照组比较,40、80mg/L组的细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05),见图1。
2.2 流式细胞仪检测凋亡结果 NaF可以促进Saos-2细胞凋亡,在5、10、20、40、80mg/L浓度下Saos-2细胞凋亡率分别为4.8%、13.8%、37.0%、58.9%、63.2%(P<0.05),呈现出剂量依赖性,其浓度越高,促凋亡作用越强,见图2。
2.3 PCR芯片检测结果 PCR芯片检测显示在总共84个检测基因中表达下调的有FBXO6基因,表达上调的有BIP、XBP1、ATF4、PERK、IRE1α、IRE1β、ERO1LB、JNK3、PDIA3、USP14、HSPA1L、HSPH1、HTRA4、UGCGL1等14个基因,图3。
图1 不同浓度NaF对人成骨肉瘤细胞Saos-2的增殖抑制作用
图2 不同浓度NaF对人成骨肉瘤细胞Saos-2的凋亡作用
2.3 Western blot检测结果 0、5、10、20、40、80mg/L NaF作用Saos-2细胞24h后抽提细胞总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分别行 EIF2Sα、ATF4、IRE1、GRP78、XBP1和CHOP蛋白检测结果。BIP表达随NaF剂量增高而增强;CHOP在40与80mg/L时表达,且逐渐增强;XBP1在5~10mg/L时,表达随NaF剂量逐渐增强,在40与80mg/L时表达减弱;ATF4表达明显随NaF剂量增高而增强;IRE1也随NaF干预剂量增高而表达增强,但不如ATF4明显;EIF2a表达在各剂量组中基本保持不变,见图4。
图4 不同浓度NaF作用于人成骨细胞24h的蛋白表达
3 讨 论
当细胞内未折叠蛋白质或错误折叠的蛋白质聚集在内质网内,即可引发内质网应激,从而进一步产生内质网应激反应,表现为UPR,以恢复或维持内质网的功能[4-5]。持续的内质网应激,如不能恢复,会导致细胞凋亡[6-7]。氟可以造成成骨细胞的内质网应激并引起UPR,并调节成骨细胞的分化和成熟[8]。引起内质网应激的途径可能是氟离子引起的过氧化反应、内质网钙代谢紊乱或者氟离子的直接化学作用[9-11]。
RT-PCR Array是目前较为简单实用的检测基因表达的方法,能够一次性检测84个与UPR相关的基因在mRNA水平上的表达,结果无需再进行实时荧光定量检测。在本研究中,下调的基因FBXO6,与诱导内质网相关性降解(ER-associated degradation,ERAD)有关。在表达上调的14个基因中,属于未折叠蛋白结合的基因有:UGCGL1、ERO1LB;属于内质网蛋白质折叠的质量控制的基因有:GANC;属于翻译调节的基因有:EIF2A;属于ERAD的基因有:HTRA4;属于泛素化有关的基因为USP14;属于转录因子的有:ATF4、XBP1、IRE1α、IRE1β;属于凋亡相关基因的有:JNK3、PERK;属于热休克蛋白的基因有:HSPA1L、HSPH1、BIP;属于蛋白质二硫键异构酶的基因有:PDIA3。
从芯片检测结果,发现过量氟引起了成骨肉瘤细胞Saos-2未折叠蛋白信号通路中多种基因有意义表达,进一步用Western blot发现BIP、CHOP、XBP1、ATF4等蛋白表达随剂量逐渐增高,ATF4、XBP1分别属于内质网应激3条通路中的两条:PERK和IRE-1,说明这两条通路均参与了氟对成骨细胞的作用。本研究中尚未发现第3条通路ATF6路径在染氟过程中的变化。尤其是PTEN途径,ATF4的蛋白表达呈现出典型的剂量反应关系。XBP1在NaF 5~20mg/L表达逐渐增强,与此时成骨细胞内质网应激状态增强有关。而在内质网应激较强状态时,40、80mg/L的表达减少,XBP1s蛋白表达受到抑制,可能是UPR受阻,进入诱导细胞凋亡[12]。而此时染氟成骨已经不能处理UPR,成骨细胞逐渐转向凋亡,这与流式细胞仪反映出的结果相符。CHOP的表达与凋亡密切相关,在芯片的检测结果中虽然没有发现其高表达,但是据已有的研究和本次实验发现,在NaF 20、40mg/L时表达明显增高,也与流式细胞仪的凋亡百分率结果相符合。
综上所述,氟所激活的UPR信号通路与成骨细胞的生长和增殖密切相关。尤其是氟中毒条件下成骨细胞内质网应激与细胞凋亡存在一定的关系,本研究仅涉及少数凋亡相关基因,与凋亡信号通路尚未联合研究,并且其发生的先后顺序仍需要进一步研究。
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