不同目标血糖脓毒症大鼠肝、肺损伤的病理分析＊

何永来，齐 妍，张景玉，朱建波，单 琦，蒋金芳，梁伟华，李洪安，程青虹▲

（1.石河子大学医学院第一附属医院ICU，新疆石河子832000；2.石河子大学医学院病理系／第一附属医院病理科，新疆石河子832002；3.石河子大学医学院预防医学系，新疆石河子832000；4.河南科技大学第一附属医院新区ICU，河南洛阳471000）

脓毒症是外科临床常见的一种危重症，除了可以引起剧烈的全身炎性反应外，还常导致肝、肺、肾、肠道和脑等多个器官的功能损伤，其中肺损伤发生早、病情重，常是患者死亡的直接原因，但是肝、肺损伤的发生机制目前尚不完全清楚[1-2]。脓毒症患者应激状态下，胰高血糖素、糖皮质激素等反向调节激素常分泌增加，而胰岛素则分泌正常或减少，使机体分解代谢和糖异生作用增强而糖原合成作用减弱，造成血糖水平升高及自由脂肪酸、酮体和乳酸产生增多，导致细胞代谢功能的失调和炎症因子级联反应的启动[3]，导致大量炎症因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-1、IL-6[4]等释放入血，加之激活的粒细胞和单核巨噬细胞释放大量的超氧化物，从而直接引起不同器官炎症损伤。同时，大量炎症因子的释放可选择性地激活转录因子、生长因子和次级调节因子，从而间接引起机体多种调节功能紊乱，进一步造成肝、肺等重要器官的损伤[5]。因此，加强对脓毒症状态下肝肺功能障碍的防治及血糖的维护具有重要的临床意义。本研究以盲肠结扎穿孔术（CLP）造成的脓毒症大鼠为模型及不同血糖控制组模型鼠，从而来评估及分析肝、肺损伤的病理形态改变，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选取40只SPF级健康雄性成年SD大鼠，体质量（300±20）g，由新疆医科大学动物实验中心提供。适应性饲养1周，温度（22±3）℃，湿度（50±20）%，每天光照12h／黑暗12 h，提供约15g全营养鼠粮及足量饮水。将SD大鼠按随机数字表法分为5组：假手术组（Sham组，n＝8）、脓毒症组（CLP组，n＝8）、血糖控制 A组（A组，n＝8）、血糖控制B组（B组，n＝8）；血糖控制C组（C组，n＝8）。各组大鼠术前禁食12h，不禁水，用1%戊巴比妥钠注射液（100mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠后，仰卧位固定，颈部和腹部备皮。各组大鼠取右颈部纵行切口1.5cm，无菌条件下分离并暴露右颈外静脉，行右颈外静脉置管术。置入直径约1.0mm的一次性硬膜外麻醉导管，置入深度约3.0cm，此时导管前端在上腔静脉内（经解剖证实），远心端一道，近心端两道结扎固定导管。建立由切口至颈背部的皮下隧道，导管由颈背部引出并穿行于弹簧内，弹簧一端固定于颈背部皮肤，另一端固定于饲养笼外的支架上。导管外端接三通管，用25U／mL肝素液0.2mL保留冲洗导管，封管备用。并通过微量注射泵静脉给药。

1.2 方法

1.2.1 脓毒症大鼠模型的制备 采用改良的CLP法制备大鼠脓毒症模型（模型成功标准：可达到动物SIRS参照标准[6]，且经病理学观察可见脓毒性肝、肺损伤）。CLP模型鼠制备具体方法：中、下腹正中切口2.0cm，在盲肠根部用无菌4号线结扎，注意避开血管，自制穿孔针在距盲肠末端1.0cm处戳孔，直径0.5cm，挤出约黄豆粒大小粪便，然后把盲肠推回腹腔，结扎离断双侧网膜，关闭腹腔，逐层缝合。术后立即皮下注射50mL／kg乳酸钠林格液，补充手术过程中的体液丢失。所有大鼠实验期间禁食经静脉给予营养支持，每日摄入总热量均控制在70kcal／只左右，此为正常成年大鼠每日正常生理需要量。

1.2.2 各组处理方案及胰岛素的配制 Sham组：仅做开关腹处理，静脉泵注与其他各组等容量的生理盐水；CLP组：行CLP，静脉泵注与各血糖控制组等容量的生理盐水；各血糖控制组（A、B、C组）：行CLP，静脉泵注胰岛素生理盐水溶液，其中A组目标血糖控制在4.4～6.1mmol／L，B组目标血糖控制在6.1～8.3mmol／L，C 组 目标血 糖控制 在 8.3～10.0 mmol／L。胰岛素用法为15U胰岛素加入生理盐水20mL内以微量泵泵入，运用快速血糖仪检测大鼠尾静脉血糖水平，及时调整胰岛素用量，间隔为1h。各组间进液体量的差异用生理盐水补齐。实验所用的胰岛素为速效胰岛素注射液。

1.2.3 肝、肺组织光镜标本的制备及组织病理评分 模型制备成功后，各组术后12h后取肝、肺组织，立即放入10%中性福尔马林固定，6～12h后进行石蜡组织包埋，制备4μm切片，苏木素-伊红（HE）染色，用中性树胶封片。光镜下观察病理组织学变化，并参考 Aslami等[7]和 Hou等[8]的方法计算肝、肺组织损伤病理评分参考：肺损伤病理评分共7项指标，（1）肺泡壁毛细血管扩张、充血；（2）肺泡腔内水肿液；（3）肺间质水肿；（4）炎性细胞浸润支气管；（5）肺泡壁增厚变宽（炎性细胞浸润或者纤维化）；（6）肺间质出血；（7）肺泡腔内见红细胞，每项指标评分为无病变计0分，＜25%计1分，25%～＜50%计2分，50%～75%计3分，＞75%计4分，再计算5个400倍视野评分的平均值。肝损伤病理评估通过8项指标，（1）肝细胞水肿；（2）脂肪变性；（3）碎片状坏死；（4）弥漫坏死或者桥接坏死；（5）肝窦扩张；（6）肝窦水肿；（7）汇管区纤维化；（8）汇管区淋巴细胞浸润（超过50个细胞）。每项指标评分：无病变计0分，＜25%计1分，25%～＜50%计2分，50%～75%计3分，＞75%计4分，再计算5个400倍视野积分的平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以±s表示，整体比较方差齐时采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肝、肺组织病理形态变化

2.1.1 各组肺损伤的病理形态改变 Sham组肺小叶组织形态无明显异常，CLP组在肺小叶及支气管壁均出现较重的化脓性炎症改变，部分肺泡腔内及支气管腔内出现脓液，间质大量中性粒细胞浸润，血管高度扩张充血（图1）。血糖控制组肺损伤的改变随着血糖水平升高损伤逐渐加重：A组＜B组＜C组，主要表现为肺泡壁毛细血管充血、肺泡壁炎症浸润程度、肺间质水肿均呈逐渐加重趋势。

图1 血糖控制B组和C组及CLP组的肺损伤病理形态改变

图2 血糖控制B组和C组及CLP组的肝损伤病理形态改变

表1 脓毒症大鼠及各血糖控制组肺损伤病理评分结果（±s，分）

表1 脓毒症大鼠及各血糖控制组肺损伤病理评分结果（±s，分）

＊：P＜0.05，与sham组比较；▲：P＜0.05，与A组比较。

总评分Sham 组 0.57±0.54 0 0.57±0.54 0.43±0.54▲ 0.14±0.38 0.57±0.54 0 2.43±0.98组别 肺泡壁淤血 肺泡腔水肿液 肺间质水肿 支气管炎症 肺泡壁增厚 肺间质出血 肺泡腔红细胞▲CLP组 2.71±0.49＊▲ 1.86±0.38＊▲ 2.71±0.49＊▲ 2.86±0.38＊▲ 2.86±0.38＊▲ 2.71±0.49＊▲ 1.86±0.38＊▲ 18.43±2.23＊▲A组 1.00±0.54 0.38±0.74 1.00±0.54 1.63±0.74＊ 0.63±1.06 1.00±0.54 0.38±0.74 7.25±4.10＊B组 1.86±0.90＊▲ 1.57±0.79＊▲ 1.86±0.90＊▲ 1.71±0.49＊ 1.86±1.07＊▲ 1.86±0.90＊▲ 1.57±0.79＊▲ 12.57±2.34＊▲C组 1.75±0.46＊▲ 1.75±0.46＊▲ 1.75±0.46＊▲ 2.88±0.35＊▲ 2.38±0.52＊▲ 1.75±0.46＊▲ 1.75±0.46＊▲ 15.88±2.64＊▲

表2 脓毒症大鼠及各血糖控制组肝损伤病理评分结果（±s，分）

表2 脓毒症大鼠及各血糖控制组肝损伤病理评分结果（±s，分）

＊：P＜0.05，与Sham组比较；▲：P＜0.05，与A组比较。

组别 肝细胞水肿 肝脂肪变性 肝窦扩张 肝窦水肿 汇管区纤维化 汇管区炎症 总评分Sham 组 0.57±0.54 0.57±0.54 0.14±0.54 0 0 0.43±0.54 1.43±0.79 CLP组 3.71±0.49＊▲ 3.71±0.49＊▲ 3.57±0.54＊▲ 3.14±0.38＊▲ 1.86±0.38＊▲ 2.43±0.54＊▲ 17.43±2.07＊▲A 组 0.75±0.46 0.75±0.46 0.63±0.74 0 0 0.50±0.54 2.25±1.67 B组 2.00±0.58＊▲ 2.00±0.58＊▲ 1.86±0.69＊▲ 1.00±0.58＊▲ 1.14±0.38＊▲ 1.43±0.54＊▲ 9.00±2.71＊▲C组 3.25±0.46＊▲ 3.25±0.46＊▲ 2.63±0.52＊▲ 1.75±0.46＊▲ 1.75±0.46＊▲ 1.75±0.46＊▲ 13.75±1.83＊▲

2.1.1 各组肝损伤的病理形态改变 Sham组肝小叶组织形态结构无明显异常，CLP组肝细胞损伤明显比其他组严重，肝细胞弥漫水样变性，部分区碎片状坏死，肝窦高度扩张、充血，汇管区可见炎性细胞浸润明显（图2）。血糖控制组3组随着血糖水平升高，其肝细胞水样变性、脂肪变性、间质炎症及间质充血均逐渐加重，依次为A组＜B组＜C组。

2.2 各组大鼠肝、肺组织损伤评价

2.2.1 肺损伤病理评分 根据Aslami等[7]肺损伤病理标准，总评分CLP组、血糖控制组与Sham组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），肺损伤程度呈逐渐加重趋势；CLP组与血糖控制A组和B组差异有统计学意义（P＜0.05），与C组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；血糖控制3组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。其余各指标组间分析比较，除A组与对照组、B组与C组之间差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2.2 肝组织损伤病理评分 根据 Hou等[8]肝组织损伤病理评分标准，5组均没有出现肝细胞弥漫坏死或者桥接坏死，且只在CLP组出现了碎片状坏死，具体评分见表2。CLP组及血糖控制组与Sham组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；肝细胞水样变性和脂肪变性这两项指标，除CLP组与血糖控制C组间差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）；对于汇管区炎症这一指标，除血糖控制B组和C组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组差异均有统计学意义（P＜0.05）。通过总评分，与Sham组比较，血糖控制A、B、C组及CLP组，肝损伤程度呈逐渐加重趋势。

3 讨 论

脓毒症是临床上一种常见但较难治疗的全身炎症反应综合征（MODS），尽管现在医疗技术日渐进步，但其病死率仍然较高。国外流行病学调查结果显示，全球每年新发重度脓毒症患者超过1 800万，发病率为0.3%，且以每年1.5%的速度递增。美国每年新增病例70万例，发病率每年增长1.5%～8.0%，其中死亡21万例，病死率大于30%[9-10]。鉴于脓毒症的危害性，2002年10月欧美国家多个组织共同发起并签署“巴塞罗那宣言”，旨在降低脓毒症病死率[11]，但目前脓毒症病死率仍在25%以上。其本质是大量细胞因子和炎症介质释放导致的宿主自身免疫性损伤，在脓毒症早期肺功能即可发生异常，并与病死率有密切关系，大约有40%～50%的患者合并肝脏、肺组织和心脏功能不全，其中约7%出现严重呼吸功能衰竭[1]。危重患者应激状态下，胰高血糖素、糖皮质激素、儿茶酚胺、生长激素等反向调节激素常分泌增加，而胰岛素则分泌正常或减少，使机体分解代谢和糖异生作用增强而糖原合成作用减弱，使血糖水平升高及自由脂肪酸、酮体和乳酸产生增多，导致细胞代谢功能的失调和炎症因子级联反应的启动，使大量炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6等释放入血，加之激活的粒细胞和单核巨噬细胞释放大量的超氧化物，从而直接引起组织细胞的炎症损伤和氧化损伤。另外，大量炎症因子的释放可选择性地激活转录因子、生长因子和次级调节因子，间接引起机体多种调节功能紊乱，其中主要为抑制内皮型一氧化氮合酶和激活野生型一氧化氮合酶，导致体内一氧化氮释放的调节紊乱，引起血管舒缩功能失调，导致肝、肺、肾、心脏等脏器的功能障碍。

脓毒症所致的多器官功能衰竭是重症监护室（ICU）患者常见的死亡原因，其中肺、心脏等功能障碍出现的较早且症状较为明显。因此，支持治疗通常集中肺、肾脏和心脏等。尤其是炎症较重时，肺部损伤更为明显。Song等[2]通过脓毒症大鼠模型所致的急性肺炎，研究脓毒症与炎症的相关性，演示了中性粒细胞在肺炎中迁移至受损组织，导致肺小叶结构及肺泡损伤病理形态改变，这种损伤危机到大鼠免疫系统，甚至是会引起死亡，而血液纯化则可能降低脓毒症的病死率。本实验也发现，CLP组所致的肺组织炎性反应最重，肺泡壁明显增厚，肺间质、肺泡壁、支气管壁，甚至肺泡腔内均可见多量中性粒细胞浸润，部分支气管腔内可见脓液。

临床ICU患者出现肝功能障碍或者肝衰竭相对较晚或少见。然而，Bulger等[13]研究发现，在113例脓毒性休克患者中，肝功能的异常主要表现为黄疸，其发生率为23%。临床上，在感染性休克患者中，肝功能明显异常者少见；个别出现肝小叶坏死的患者可表现出短暂的（5～25d）、血清酶升高（正常上限10～300倍）。此种临床现象曾被称为“休克肝”。本研究CLP组的肝损伤以变质性炎为主，较对照组肝细胞弥漫水样变性，部分区碎片状坏死，肝窦高度扩张、充血，汇管区可见炎细胞浸润明显。

临床观察发现，危重患者不仅常出现血糖水平升高，而且还常伴发血脂代谢障碍，主要表现在血三酰甘油的升高和高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的降低。而研究显示，强化胰岛素治疗可以显著改善血脂代谢异常，使危重患者的血三酰甘油降低、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白升高，从而有利于血清脂质的转运和内毒素的清除、改善患者预后。血糖水平升高后可作用于内皮细胞，使其释放组织纤溶酶原激活物抑制剂-1和激活von Willebrand因子，从而引起血浆纤维蛋白溶解减少和血小板高度激活，加之内皮细胞释放内皮素和血栓素B2等内源性物质引起微循环血管强烈收缩，使组织细胞缺血坏死，引起弥散性血管内凝血（DIC），最终导致MODS的发生[5]。应激性高血糖除了致炎作用外，还存在免疫抑制作用，主要表现在以下3个方面：（1）高血糖可以导致白细胞的黏附、趋化、吞噬、细菌杀伤和呼吸爆发等功能受损；（2）高血糖可以导致外周血B淋巴细胞和T细胞的凋亡增加，使其数量明显减少；（3）高血糖可以导致免疫球蛋白糖基化，使其免疫功能下降。另外，由于危重患者往往存在免疫功能失调，所以极易发生严重感染[5]。本研究结果显示，随着血糖水平升高，肝、肺组织损伤均逐渐加重，依次为A组＜B组＜C组。A组血糖在正常范围内，其病变也最轻微，比Sham组的损伤稍重，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示脓毒症大鼠血糖维持在正常范围内时，可减少或减慢病情的进展。血糖一旦持续升高，肝、肺组织病变即开始加重。有文献表明，机体大部分组织细胞的葡萄糖摄取是直接依赖于细胞膜上的葡萄糖转运体进行的，高血糖尤其是危重患者更容易出现细胞内糖超载，从而增强细胞的氧化应激，使氧自由基产生增多，导致组织细胞损伤；此外，细胞内糖超载还可以引起细胞的形态及功能异常，尤其是影响线粒体的形态及功能，线粒体功能失调引起组织细胞能量代谢紊乱，最终导致器官功能衰竭。

综上所述，脓毒症大鼠中血糖升高后明显使得肝、肺组织病变加重，而将血糖维持在正常范围内，肝、肺组织病变明显减轻，这提示在临床工作中，进行强化胰岛素治疗，也许可以降低脓毒症患者的病死率和减低或者避免多器官功能障碍或衰竭。

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