活性维生素D及其类似物对足细胞保护的作用机制

江罗佳综述，房向东，涂卫平审校

0 引 言

1，25-(OH)2D3在调节肾多种生理功能的同时发挥着抗蛋白尿的肾保护作用，足细胞表面维生素D受体的发现，使人们认识到1，25-(OH)2D3可以足细胞作为靶点而减少蛋白尿的排泄，其发生机制可能与抑制足细胞肾素-血管紧张素(Renin-angiotensin system，RAS)系统、调节脂质代谢紊乱及炎症应答、低足细胞活动力、阻断p-Smad2/3与 p-Smad1/5/8、Wnt/β-catenin 和足细胞内瞬间受体电位阳离子通道6(Transient receptor potential cation channe，TRPC6)信号通路降有关。

1 活性维生素D与慢性肾病(Chronic kidney disease，CKD)

1，25-(OH)2D3升高血钙、降低血磷、降低甲状旁腺素(Parathyroid hormone，PTH)的特性使其广泛运用于CKD患者。为减少1，25-(OH)2D3在治疗中出现的转移性骨病和血管钙化等不良反应，人们一直在寻求不升高血钙或升高血钙作用弱的维生素D类似物，如帕骨化醇和氧杂骨化醇等。临床上将高磷、低钙、低1，25(OH)2D3、继发性甲状旁腺功能亢进、高成纤维细胞因子23血症等认为是CKD矿物质代谢的典型五联并发症。我国临床实践指南建议使用1，25-(OH)2D3指征为:CKD3～4期患者血免疫反应性甲状旁腺激素(immunoreactive parathyroid hormone，iPTH)超出靶目标且限磷治疗无效;CKD5期血液透析或腹膜透析患者 iPTH ＞300 pg/mL、血总钙 ＜2.4 pg/mL及血磷小于 1.5 pg/mL［1］。Wang 等［2］应用高特异性及强敏感性的维生素D受体(Vitamin D receptor，VDR)抗体，并利用荧光免疫法检测肾组织VDR分布，证实了VDR存在远端肾小管、近端肾小管、球旁致密斑及足细胞。在肾小球系膜细胞、肾小管间质细胞及球旁细胞能检测到极少量甚至检测不到VDR。随着深入的研究，发现1，25-(OH)2D3还具有抗炎、调节细胞凋亡、介导免疫及减少蛋白尿的肾保护作用，而多数文献证实肾小球的脏层上皮细胞即足细胞是其主要的作用靶点［3-4］。

2 活性维生素D与足细胞病

临床上很多肾病都存在肾病范围的蛋白尿，这类疾病的肾活检标本共同特征是电镜下足突融合，免疫病理寡免疫复合物(IgM、c3、Clq少量)沉积，故称足细胞病，它包括了微小病变肾病(Minimal change nephropathy，MCN)、局灶节段性肾小球硬化(Focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)、糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)、IgA肾病、淀粉样变肾病、膜性肾病、脂质肾损害、新月体肾病、狼疮足细胞病、肥胖相关性肾病等，其中MCN与FSGS被认为是最具特征性的足细胞病［5］，阐明足细胞损伤出现大量蛋白尿的分子机制具有重要的临床意义。Wang等［6］用 2.5 kb 的 podocin 蛋白靶向结合小鼠足细胞上VDR，并与野生型小鼠(非人工诱变基因的小鼠)对照，链脲佐菌素诱导的糖尿病的病理环境中，发现在转基因小鼠用低剂量的1，25-(OH)2D3类似物可减少蛋白尿，明显抑制足细胞丢失及细胞凋亡，同时抗肾小球纤维化，野生型小鼠糖尿病肾病无此效果。此实验证明，维生素D/VDR信号在足细胞中起着关键作用，在糖尿病损伤肾的保护中尤其重要。在生理条件下，脂溶性的1，25-(OH)2D3及其类似物易透过细胞膜与VDR相结合使后者发生构象变化，启动信号转录，调节靶因子，最终上调Nephrin、Podocin表达，同时下调足细胞损伤因子desmin表达，增加足细胞数目及减少足细胞体积肥大，足突间的裂孔膜维持正常的形态，可见1，25-(OH)2D3可通过调节足细胞内信号分子起到减少蛋白尿，保护肾功能的作用。

3 维生素D对足细胞的作用机制

3.1 RAS系统激活导致的足细胞损伤 1，25-(OH)2D3参与多种途径保护足细胞结构和功能的完整性，目前研究最多的是抑制RAS系统激活而保护足细胞。足细胞可降解从肾小球滤过的全身性血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)或诱导从肾小球滤过的AngⅠ和血管紧张素原向其他活性物质转化，以此调节全身RAS系统成分对足细胞的损害，但足细胞并不能降解过度激活的RAS系统成分。多数实验证明1，25-(OH)2D3对 RAS系统的抑制主要表现在［7-8］:①通过干扰环磷酸腺苷途径抑制肾素的产生;②阻断NF-κB途径下调血管紧张素原表达;③直接下调肾素、血管紧张素转化酶Ⅰ mRNA的表达，同时上调Podocin、WT-1等分子的表达。Liebau 等［9］在早期研究中发现肾组织内可分泌RAS系统中的任一成分，并且认为局部分泌的RAS系统成分对足细胞的损伤更为重要。董婷等［10］研究中亦发现肾组织中局部分泌的RAS成分含量明显高于循环中RAS成分，但在DN的病理环境中，局部分泌ARS成分对足细胞损伤的机制尚不明确，1，25-(OH)2D3对局部RAS系统成分是否有干扰作用，目前国内外研究的文献不多，还有待进一步研究。

3.2 p-Smad2/3与p-Smad1/5/8信号通路介导的损伤 Smad蛋白是转化生长因子1(Transforming growth factor 1，TGF-β1)超家族成员细胞内的信号传导蛋白，膜受体激活型主要包括p-Smad2/3与p-Smad1/5/8 2大类，TGF-β1与胞膜受体结合后通过磷酸化途径激活Smad2/3，后者转移至核内与特异启动区域结合，诱导足细胞表面大量表达desmin蛋白，导致足细胞增生、肥大、脱落及凋亡［11］。骨形态发生蛋白 7(Bone morphogenetic protein 7，BMP-7)是足细胞存活因子，通过激活p-Smad1/5/8信号通路阻断 TGF-β1效应产生保护足细胞作用［12］。Dessapt等［13］将小鼠足细胞暴露于富含TGF-β1的环境中培养 48h，发现足细胞表面 ɑ3β1整合素数量明显降低，同时足细胞凋亡数目也明显增加，这是由于ɑ3β1整合素表达降低能削弱足细胞黏附于肾小球基底膜的能力，使之脱落至尿液中。邹敏书等［14］研究得出，1，25-(OH)2D3可直接下调足细胞表面TGF-β1表达，同时增加ɑ3β1整合素的数量，增加足突间的黏附力，维持足细胞数目和形态的完整，亦可增加足细胞上BMP-7表达拮抗TGF-β1的促凋亡作用。近期，Kim等［15］利用一种脂质氧化的醛产物诱导人肾近曲小管上皮细胞(Human renal proximal tubule epithelial cells，HK-2)内 TGF-β/Smad通路信号增强，加入帕骨化醇干预后发现通过抑制该通路的信号转导，从而抑制HK-2细胞炎症及上皮-间质转分化过程，此研究得出，1，25-(OH)2D3在足细胞内介导的抗蛋白尿作用机制与TGF-β/Smad通路信号有可能息息相关。

3.3 脂质代谢紊乱导致的足细胞损伤 Joles等［16］在早期以小鼠为实验对象的研究中就提出高血脂能导致足细胞损伤，在伴有继发性肾小管间质损害的经典节段硬化性肾炎中，这种损伤十分常见。血清中循环脂质及脂肪细胞因子能直接导致足细胞损伤，这种病理状态在糖尿病患者体内尤其明显。Podcin是足细胞在进化过程中保留的一个新颖的脂质结合蛋白分子家族成员，参与调节滤过膜上脂质的信号转导。编码Podocin的NPHS2基因突变可导致激素抵抗性肾病综合征，此类型疾病存在持续大量的蛋白尿。Podocin分子能通过PHB域和位于疏水区的蛋白分子结合并聚集胆固醇分子，最终在滤过膜区形成蛋白-脂质超复合体［17］。Wang 等［18］发现维生素受体激动剂度骨化醇通过与VDR结合可减少足细胞内中性脂质(三酰甘油和胆固醇)及亲脂素的表达，该机制是通过下调 SREBP-1和SREBP-2表达和靶酶介导抑制脂肪酸及胆固醇合成，同时增加足细胞上尼脂酰X受体促进脂肪细胞代谢。

3.4 足细胞内炎症应答介导的损伤 在糖尿病病理条件下，足细胞可表达及分泌单核细胞趋化因子(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)到尿液中，尿MCP-1分子的排泄量可反应糖尿病患者肾组织中的炎症程度，也可在抗感染治疗结束后进行有效评估［19］。Rosa等［20］发现处于活动期的狼疮性肾炎中，与抗ds-DNA抗体升高和C3降低一致的是尿，MCP-1也明显高于非活性SLE，指出尿MCP-1可作为SLE活动性评价的一个新型生物指标。Sanchez-Niño等［21］在培养足细胞实验中，发现生理剂量的帕立骨化醇及骨化三醇可明显下调高糖诱导的足细胞内MCP-1和IL-6因子活性，降低炎性反应水平，抑制纤维连接蛋白mRNA表达，同时指出VDR激活具有肾局部的抗炎作用，即使蛋白尿未减少，也能使足细胞中的炎性反应降低。同样，Yang等［22］通过收集糖尿病及糖尿病非透析患者的血清，用ELISA法检测MCP-1和IL-6因子浓度是明显升高的，在用1，25-(OH)2D3干预后的上述指标浓度有所降低。

3.5 TRPC6启动介导的损伤 TRPC6是位于裂孔膜上的一种新型的足细胞相关蛋白，参与调节肾小球过滤功能。AngII可上调足细胞内TRPC6 mRNA及蛋白水平的表达，TRPC6的表达提高与肾小球损伤指标及肾小球硬化有着密切关系。Yang等［23］在研究高糖诱导足细胞凋亡的实验中发现足细胞内存在TRPC6及TRPC6依赖的Ca2+内流增加，在敲除TRPC6后因其下游系列活化受阻而干扰足细胞损伤。同样，实验证明 AngII诱导 TRPC6介导的Ca2+内流增加，同时活化钙调神经磷酸酶及调节活化T细胞核因子正反馈通路，从而导致足细胞损伤［24］。Ca2+内流增加是因为在足细胞表面具有功能性的TRPC6通道数量增多，和/或这些通道活性的增加会损伤滤过膜结构完整性，导致大量的蛋白尿。另一项实验是体外培养基中用阿霉素诱导足细胞损伤，给予1，25-(OH)2D3治疗发现可呈剂量依赖性减少足细胞内TRPC6表达，用染色质免疫沉淀法分析，发现维生素D受体VDR可直接结合TRPC6启动子，从而在分子水平抑制TRPC6 mRNA转录及其蛋白合成，最终降低蛋白尿的产生［25］。在VDR编码基因敲除小鼠肾组织中，TRPC6的表达明显提高，同时出现足细胞间足突融合及大量蛋白尿现象。

3.6 降低足细胞的活动力 尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(Urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)是一种糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白，能与一些跨膜蛋白如整合素、小窝蛋白等结合形成信号复合体，在炎症、肿瘤浸润和转移中起重要作用。在肾组织中，足细胞表面的uPAR高表达可导致足细胞活动力增强与足突融合，从而导致大量蛋白产生［26］。马建超等［27］实验通过用脂多糖培养足细胞诱导其表面骨架蛋白的重排，导致足细胞活动能力增高，在体外随机对照实验中，脂多糖组足细胞迁移能力明显高于正常对照组和脂多糖 +1，25(OH)2D3组，研究发现脂多糖诱导受损的足细胞uPAR蛋白及Plaur mRNA表达升高，而1，25(on)2D可能通过抑制uPAR的表达，降低足细胞活动力，起到保护足细胞的作用。有研究表明人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)可通过抑制RAS系统激活来下调足细胞表明的VDR受体数目［28-29］，导致足细胞内肌动蛋白骨架成分降低，足细胞活动力下降。HIV相关性肾病的病理损害以塌陷型FSGS为特点，1，25(OH)2D3作用以维生素D/VDR信号传导为基础，由此得知，1，25(OH)2D3也可通过改善足细胞活动力的方式发挥HIV相关性肾病中降低尿蛋白的效果。

3.7 Wnt/β-catenin通路介导的足细胞上皮间质转化 Wnt/β-catenin是一个进化过程中保守的细胞信号传导系统，在保持组织和器官的物种进化的多样化调控中起重要作用，也是导致多种疾病(如增殖性炎症、肿瘤等)的主要发病机制。当肾受到外界损伤刺激时，Wnt蛋白与细胞表面受体Frizzled家族跨膜蛋白受体结合，与之结合的包括其他辅助受体，如低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6，配体受体结合后导致 β-catenin去磷酸化使其至核内与T细胞因子及淋巴增强因子结合，刺激Wnt靶基因转录活动增强，导致肾组织损伤并持续进展。在CKD中晚期患者体内普遍缺乏1，25(OH)2D3，在这些患者体内大多数存在Wnt/β-catenin信号激活。Li等［30］在小鼠足细胞内发现在TRPC6介导糖尿病足细胞损伤中存在Wnt/β-catenin信号通路活化。Larriba等［31］研究提出VDR能控制结肠癌细胞核内β-catenin水平，通过激活Wnt/β-catenin信号通路途径来衰减体内致癌基因突变的影响。He等［32］用阿霉素诱导的足细胞损伤也发现存在Wnt/β-catenin通路激活，用帕立骨化醇干预可选择性抑制Wnt4基因表达，同时抑制阿霉素诱导的足细胞内β-catenin信号和Snail信号(Wnt/β-catenin信号通路的下游效应)的激活。最新实验研究发现，在成年小鼠体内条件性表达端粒酶的蛋白质成分，即端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)时，足细胞会迅速失去分化标记并进入细胞周期，在成年鼠体内进行转基因TERT的表达能诱导Wnt信号明显上调，导致塌陷型的局灶节段硬化性肾病［33］。端粒酶功能失常会让细胞周期无限制延长，导致恶性肿瘤的发生，1，25(OH)2D3能否通过调节端粒酶活动而影响Wnt/β-catenin信号通路转导，又能否从某种机制有效地保护端粒酶功能，值得我们进一步探讨。

4 结 语

综上所述，1，25(OH)2D3及其类似物可通过多种信号转导途径保护足细胞避免损伤，一定程度上降低蛋白尿水平，减少CKD进展的危险因素。尤其是近几年来新型1，25(OH)2D3类似物不断出现，高钙血症、转移性钙化等不良反应大大降低，同时Ferder等［34］提出体内低维生素D水平也是自身免疫性疾病、神经性疾病、心血管疾病、代谢性疾病及癌症发生的危险因素，目前，体内最佳维生素D水平存在争议，但人们一致认为对于风险人群的维生素 D 状态应该被改善［35］，相信 1，25(OH)2D3在CKD中的临床应用适应征会更加宽广。目前国内外学者还发现足细胞内Notch信号、BKca通道及醛固酮调制信号平衡失调均参与大量蛋白尿的产生［36-38］，但具体损伤机制尚不明确，潜在的分子干扰机制对筛查新1，25(OH)2D3类似物治疗肾疾病有重要意义，并可能成为治疗的新突破，有重要的研究价值。

［1］陈香美.临床诊断指南·肾脏病学分册［M］.北京:人民卫生出版社，2009:250.

［2］Wang Y，Borchert ML，Deluca HF.Identification of the vitamin D receptor in various cells of the mouse kidney［J］.Kidney Int，2012，81(10):993-1001.

［3］Mirkovic K，van den Born J，Navis G，et al.Vitamin D in chronic kidney disease:new potential for intervention［J］.Curr Drug Targets，2011，12(1):42-53.

［4］Cheng X，Zhao X，Khurana S，et al.Microarray analyses of glucocorticoid and vitamin D3 target genes in differentiating cultured human podocytes［J］.PLoS One，2013，8(4):e60213.

［5］陈意志，赵学智，吴 俊.从局灶节段性肾小球硬化的哥伦比亚病理分型到足细胞病的分类［J］.中华肾脏病杂志，2009，25(9):734-738.

［6］Wang Y，Deb DK，Zhang Z，et al.Vitamin D receptor signaling in podocytes protects against diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23(12):1977-1986.

［7］Deb DK，Chen Y，Zhang Z，et al.1，25-Dihydroxyvitamin D3 suppresses high glucose-induced angiotensinogen expression in kidney cells by blocking the NF-{kappa}B pathway［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2009，296(5):F1212-F1218.

［8］Saito Y，Okamura M，Nakajima S，et al.Suppression of nephrin expression by TNF-alpha via interfering with the cAMP-retinoic acid receptor pathway［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2010，298(6):F1436-F1444.

［9］Liebau MC，Lang D，Böhm J，et al.Functional expression of the renin-angiotensin system in human podocytes［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290(3):F710-F719.

［10］董 婷，袁伟杰.肾素-血管紧张素系统活性亢进参与糖尿病肾病足细胞的损伤［J］.中华肾脏病杂志，2012，28(4):341-345.

［11］李卫国，李宇宁，周晓菊，等.desmin和转化生长因子β1在阿霉素损伤足细胞中的表达及活性维生素D的干预作用［J］.中华肾脏病杂志，2012，28(8):645-646.

［12］Xiao HQ，Shi W，Liu SX，et al.Podocyte injury is suppressed by 1，25-dihydroxyvitamin D via modulation of transforming growth factor-beta 1/bone morphogenetic protein-7 signalling in puromycin aminonucleoside nephropathy rats［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36(7):682-689.

［13］Dessapt C，Baradez MO，Hayward A，et al.Mechanical forces and TGFβ1 reduce podocyte adhesion through ɑ3β1 integrin downregulation［J］.Nephrol Dial Transplant，2009，24(9):2645-2655.

［14］邹敏书，余 健，聂国明，等.活性维生素D调节尿毒症大鼠骨形态发生蛋白-7和转化生长因子-β1的表达［J］.实用儿科临床杂志，2011，26(5):339-341.

［15］Kim CS，Joo SY，Lee KE，et al.Paricalcitol attenuates 4-hydroxy-2-hexenal-induced inflammation and epithelial-mesenchymal transition in human renal proximal tubular epithelial cells［J］.PLoS One，2013，8(5):e63186.

［16］Joles JA，Kunter U，Janssen U，et al.Early mechanisms of renal injury in hypercholes-terolemic or hypertriglyceridemic rats［J］.J Am Soc Nephrol，2000，11(4):669-683.

［17］Schermer B，Benzing T.Lipid-protein interactions along the slit diaphragm of podocytes［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20(3):473-478.

［18］Wang XX，Jiang T，Shen Y，et al.Vitamin D receptor agonist doxercalciferol modulates dietary fat-induced renal disease and renal lipid metabolism［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2011，300(3):F801-F810.

［19］Xing Y，Ye S，Hu Y，et al.Podocyte as a potential target of inflmmation，role of hydrochloride pioglitazone in type 2 diabetics［J］.Endocr Pract，2012，18(4):493-498.

［20］Rosa RF，Takei K，Araújo NC，et al.Monocyte chemoattractant-1 as a urinary biomarker for the diagnosis of activity of lupus nephritis in Brazilian patients［J］.J Rheumatol，2012，39(10):1948-1954.

［21］Sanchez-Niño MD，Bozic M，Córdoba-Lanús E，et al.Beyond proteinuria:VDR activation reduces renal inflammation in experimental diabetic nephropathy［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2012，302(6):F647-F657.

［22］Yang M，Shen Z，Chen D，et al.Effects of 1，25-(OH)(2)D(3)on the expressions of vitamin D receptor，STAT5 and cytoskeletal rearrangement in human monocytes incubated with sera from type 2 diabetes patients and diabetic nephropathy patients with uremia［J］.Inflamm Res，2012，61(5):511-520.

［23］Yang H，Zhao B，Liao C，et al.High glucose-induced apoptosis in cultured podocytes involves TRPC6-dependent calcium entry via the RhoA/ROCK pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，434(2):394-400.

［24］Nijenhuis T，Sloan AJ，Hoenderop JG，et al.Angiotensin II contributes to podocyte injury by increasing TRPC6 expression via an NFAT-mediated positive feedback signaling pathway［J］.Am J Pathol，2011，179(4):1719-1732.

［25］Sonneveld R，Ferrè S，Hoenderop JG，et al.Vitamin D downregulates TRPC6 expression in podocyte injury and proteinuric glomerular disease［J］.Am J Pathol，2013，182(4):1196-1204.

［26］Wei C，El Hindi S，Li J，et al.Circulating urokinase receptor as a cause of focal segmental glomerulosclerosis［J］.Nat Med，2011，17(8):952-960.

［27］马建超，史 伟，章 斌，等.1，25-二羟基维生素D3通过抑制尿激酶型纤溶酶原激活剂受体表达降低足细胞活动力［J］.中国新药与临床杂志，2012，31(7):401-405.

［28］Chandel N，Sharma B，Husain M，et al.HIV compromises integrity of podocyte actin cytoskeleton through downregulation of vitamin D receptor［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2013，304(11):1347-1357.

［29］Salhan D，Husain M，Subrati A，et al.HIV-induced kidney cell injury:role of ROS-induced downregulated vitamin D receptor［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2012，303(4):F503-F514.

［30］Li Z，Xu J，Xu P，et al.Wnt/β-catenin signalling pathway mediates high glucose induced cell injury through activation of TRPC6 inpodocytes［J］.Cell Prolif，2013，46(1):76-85.

［31］Larriba MJ，Ordóñez-Morán P，Chicote I，et al.Vitamin D receptor deficiency enhances Wnt/β-catenin signaling and tumor burden in colon 0cancer［J］.PLoS One，2011，6(8):e23524.

［32］He W，Kang YS，Dai C，et al.Blockade of Wnt/β-catenin signaling by paricalcitol ameliorates proteinuria and kidney injury［J］.J Am Soc Nephrol，2011，22(1):90-103.

［33］Shkreli M，Sarin KY，Pech MF，et al.Reversible cell-cycle entry in adult kidney podocytes through regulated control of telomerase and Wnt signaling［J］.Nat Med，2012，18(1):111-119.

［34］Ferder M，Inserra F，Manucha W，et al.The world pandemic of Vitamin D deficit could possibly be explained by cellular inflammatory response activity induced by the renin angiotensin system［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2013，182(4):1196-1204.

［35］祁晓平，黎介寿.维生素D作为开环甾体激素的研究进展［J］.医学研究生学报，2013，26(7):748-750.

［36］Ueno T，Kobayashi N，Nakayama M，et al.Aberrant Noth 1-dependent efffects on glomerular parietal epithelial cells promotes collapsing focal segmental glomerulosclerosis with progressive podocyte loss［J］.Kidney Int，2013，83(6):1065-1075.

［37］Zhang R，Sun H，Liao C，et al.Chronic hypoxia in cultured human podocytes inhibits BKCa channels by upregulating its β4-subunit［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，420(3):505-510.

［38］Yuan Y，Huang S，Wang W，et al.Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α ameliorates mitochondrial dysfunction and protects podocytes from aldosterone-induced injury［J］.Kidney Int，2012，82(7):771-789.