Nrf2出核转运机制及意义的研究进展

段家翔综述，甯交琳，鲁开智审校

0 引 言

核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)属于C'n'C转录因子家族，在各种组织细胞中广泛表达，是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子。主要通过与抗氧化顺势作用元件(anti-oxidative response element，ARE)结合以调控ARE控制基因的表达。ARE控制基因包括抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因、应激基因等［1］。

Nrf2的缺失会导致氧化应激条件下ARE控制基因表达的减少，增加细胞对氧化应激的敏感性。同时，值得注意的是Nrf2在细胞核内的过度激活也会造成有害的影响，如缺陷细胞的持续存活、肿瘤形成、耐药性的产生等［2］。因此，适时终止Nrf2在核内的转录活性是避免上述有害影响的根本途径，而出核转运正是Nrf2转录调控活性消失的过程。

1 Nrf2 的分子结构及转录机制

Nrf2是C'n'C家族中的一个具有碱性亮氨酸拉链结构(basic leucine zipper，bZip)的转录因子［3］，含有6个高度保守的环氧氯丙烷相关蛋白同源结构域(Nrf2-epichlorohydrin homology，Neh)［3-5］，分别为:①Neh1区，含有功能性核定位信号(nuclear localization signal，NLS)和富含亮氨酸的核输出信号(nuclear export signal，NES)，参与调控Nrf2的核转位和降解;②Neh2区，与细胞质蛋白Keap1的Kelch区相结合;③Neh3区，是活化转录所必需的;④Neh4区和Neh5区，两者协同激活环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic AMP response element-binding protein，CREB)结合蛋白;⑤Neh6区，与Nrf2氧化-还原非依赖的负性调节有关。

在基础条件下，大部分Nrf2与其特异性抑制剂Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein1，Keap1)相偶联，在细胞质中通过泛素介导的蛋白降解系统维持Nrf2的基础水平;另一部分Nrf2以活性状态存在于细胞核中介导下游基因的基本转录。当受到亲电子物质或氧化剂作用时，Nrf2与Keap1解偶联进而转移入核，再与其专性伴侣——肌腱膜纤维肉瘤蛋白(musculoaponeuroticfibrosarcoma protein，Maf)结合成异二聚体，然后识别并结合ARE，启动Ⅱ相解毒酶等多种不同类型基因的转录［4］。在抗氧化反应的后期，Nrf2与Maf和ARE序列解离并转运出细胞核，在细胞质通过Cullin3依赖的E3泛素连接酶(E3 ubiquitin ligase)机制进行泛素化后降解，使细胞内总的Nrf2活性回到基础水平［6］。

2 Nrf2 的出核转运机制

既往对Nrf2的研究主要集中在Nrf2如何与Keap1解离，进而转入细胞核发挥转录活性，以及Nrf2诱导何种下游基因的表达等方面。近年来，由于认识到Nrf2在核内的过度累积会造成不利影响，于是对Nrf2在核内诱导抗氧化应激基因表达后终止其转录活性并转运出核降解的机制进行深入研究。目前，关于Nrf2的出核转运机制主要有2种研究结论:①位于Nrf2上的核输出信号(nuclear export signal，NES)介导的Nrf2出核转运;②Keap1介导的Nrf2出核转运。

2.1 Nrf2 NES介导的出核转运机制 Abhinav等［7］提出，Nrf2的出核转运是由位于Nrf2上的NES所介导。目前发现Nrf2上存在2个NES结构，一个NES位于Zip二聚体化结构域(537L-K-K-Q-L-ST-LY-L546)，称为 NESzip［7-8］。它具有典型的富含亮氨酸的NES特征，即Φ1XXXΦ2XXΦ3XΦ4，其中4个Φ的位置必须是疏水性氨基酸残基如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸，X可以是任何氨基酸［9-10］。另一个 NES位于 Neh5反式激活区域(175L-L-S-I-P-E-L-Q-C-L-N-I186)，称为 NESTA，TA(transactivation domain)是 Nrf2同 ARE/DNA结合的结构域［11-12］。

NES在Nrf2出核转运中具有重要作用，且Nrf2的NES与Zip结构域存在重叠现象［8］。因此在氧化应激的条件下，Nrf2从 Keap1-Nrf2复合体上解离，由细胞质转入细胞核。细胞核中的Maf蛋白识别并结合Nrf2上的Zip结构域，同时遮盖了NESzip。紧接着Nrf2-Maf异二聚体与ARE结合，又遮盖了NESTA。2个 NES结构域的遮盖使出核转运体CRM1不能与 Nrf2结合，从而无法介导其出核［12-13］。当Nrf2转录激活 ARE基因的功能完成后，与ARE和Maf分离，2个NES结构域又重新暴露，被CRM1识别并结合后转运出核［7］。在Nrf2抗氧化应激反应的过程中，如果NES结构域缺失或使用CRM1特异性抑制剂leptomycin B阻断CRM1与NES的结合，则Nrf2不能被转运出核［7］。

另外，研究发现Src家族的亚族成员Fyn，Src，Yes和 Fgr激酶可催化 Nrf2第568位酪氨酸(Try568)发生磷酸化修饰，该修饰在Nrf2出核转运中也发挥重要作用，即磷酸化的Try568可使Nrf2与CRM1结合而被转运出核［14］。如果将第568位酪氨酸替换为丙氨酸，使该位点不能发生磷酸化修饰，Nrf2则不能被转运出核。实验已证实阻断Fyn等激酶可明显减少Nrf2出核转运。然而Try568磷酸化修饰后通过何种机制将Nrf2转运出核，目前尚不清楚［14-17］。

2.2 Keap1介导的Nrf2出核转运机制 Velichkova等［18］通过Keap1的蛋白序列分析发现Keap1上有潜在的NES结构域(第272到322位氨基酸)，该区域是核转运蛋白CRM1所包绕的部位。由此提出另一种Nrf2的出核转运机制，即由Keap1介导的Nrf2出核转运。进一步研究表明［19］，CRM1结合的具体区域位于第272到315位氨基酸之间，并且被疏水氨基酸所隔开。这些疏水氨基酸通常是亮氨酸或者异亮氨酸，表示为Lx(1-3)Lx(2-4)LxL。该NES位于Keap1的干预区，并在所有物种之间高度保守。在删除NES后，Keap1不再大量转移出核，也使Nrf2不再随之出核，导致了Nrf2在细胞核内的大量累积。因此，Keap1上的NES是维持Keap1和Nrf2存在于胞质中的因素。

基于上述研究，Velichkova等［18］提出 Keap1 和Nrf2作为一个复合体而存在于细胞质中。Nrf2有1个NLS结构域，而Keap1有1个依赖CRM1介导出核的NES结构域。在非氧化应激条件下，NES的作用强于NLS，因此大部分 Keap1-Nrf2复合体由于CRM1介导的出核转运而主要位于胞质中，且经过泛素化途径介导而降解。同时，小部分的Nrf2从Keap1-Nrf2复合体中解离出来进入细胞核转录激活ARE基因，维持ARE基因在基础条件下的表达水平。在氧化应激条件下，Keap1介导的Nrf2泛素化及降解减弱，同时由于Nrf2的生成未受影响，于是Keap1上的Nrf2结合位点被迅速饱和，导致新生成的Nrf2不能继续与Keap1结合而成为游离的Nrf2。游离的Nrf2在自身NLS的介导下进入细胞核中，与Maf蛋白结合，继而转录激活ARE基因［11］。当Nrf2完成转录激活ARE基因后，细胞质中的Keap1又进入细胞核，使Nrf2从ARE和Maf的结合中分离，然后形成Keap1-Nrf2复合体。CRM1识别该复合体Keap1上的NES并与之结合，继而将其转运出核。在细胞质中，Keap1-Nrf2复合体与E3泛素化连接酶结合使Nrf2降解，从而终止Nrf2信号通路。

尽管研究证实Nrf2上也含有2个NES结构域，但是Sun等［11］提出只有Keap1上的NES才真正介导了Nrf2的出核转运，证据如下:①Keap1上的NES导致了Keap1-Nrf2复合体在完成诱导后的出核转运;②Keap1-Cul3-Rbx1E3泛素化连接酶复合体在胞质中将Nrf2泛素化，证明Nrf2的降解发生在胞质，因为泛素化和降解是偶联反应;③Keap1-Nrf2复合体不能与ARE结合，提示Keap1在诱导完成后进入细胞核的目的是为了使Nrf2从ARE上分离，以关闭抗氧化应激反应;④Keap1可不依赖其他因子转入细胞核，意味着Keap1可能有1个非典型的NLS序列，此序列受细胞质氧化还原状态的调控;⑤在诱导完成后，Keap1携 Nrf2转运出核对抑制Nrf2的活性具有关键作用。Keap1转运通路的破坏将延长Nrf2介导的抗氧化应激反应后恢复正常氧化还原状态的时间。

此外，Kaspar等［20］还提出了另一种Keap1介导的Nrf2出核转运机制:Keap1与Cul3和Rbx1形成Keap1-Cul3-Rbx1复合体进而介导Nrf2转运出核。与Sun等［11］提出的出核转运机制的不同之处在于:在氧化应激时，当Nrf2完成激活细胞保护基因后，Keap1-Cul3-Rbx1作为一个复合体而不是Keap1单独进入细胞核结合Nrf2，形成Keap1-Cul3-Rbx1-Nrf2复合体。随后该复合体中的Keap1第85位酪氨酸发生磷酸化修饰，导致 Keap1上的 NES暴露，被CRM1识别并结合，继而将Keap1-Cul3-Rbx1-Nrf2复合体转运出核降解。

3 Nrf2 出核转运的意义

Nrf2通过与ARE基因结合，可启动多种基因的表达，在抗肿瘤、抗凋亡、抗炎症反应、抗动脉粥样硬化、神经保护等方面发挥着广泛的细胞保护功能。然而，随着近年来研究的深入，发现Nrf2在细胞核内的过度激活和堆积同样会造成细胞的损害，因此要求Nrf2在完成基因激活后能够快速降解。虽然目前关于Nrf2出核转运机制存在不同的研究结论，但普遍认同是无论通过哪种机制，出核转运都是Nrf2在胞质中快速降解的前提［7］。换言之，出核转运对于避免Nrf2在细胞内过度激活导致细胞损伤具有重要的意义。

3.1 维持对氧化应激反应的正常应答 正常情况下，Nrf2转换率非常快，测试结果显示其半衰期只有15 min。说明在完成转录激活功能后，Nrf2即被转运到细胞质迅速降解［21-22］。因此，Nrf2信号通路能够随着细胞氧化还原状态的改变而快速启闭，从而维持细胞对氧化应激反应的正常应答。Nrf2的过度激活和长时间的抗氧化应激反应会导致细胞对氧化应激无应答，最终造成机体不可逆的损害。

3.2 防止耐药性的产生 由于Nrf2诱导解毒酶和抗氧化酶的性质，使其在耐药性的产生中扮演了重要角色［23-30］。持续过度表达Nrf2导致肿瘤细胞对化疗药物如顺铂、阿霉素、依托泊苷产生耐药性。而在很多癌症的治疗过程中，耐药性的产生是阻碍治疗效果的关键因素，如神经母细胞瘤、乳腺癌和肺癌。Nrf2在这些肿瘤中的上调增加了细胞对化疗药物的抵抗，而下调则可增加细胞对化疗药物的敏感性。如果在化疗药物的使用过程中辅以Nrf2的抑制剂可使肿瘤细胞最大程度死亡。因此，推测在使用化疗药物治疗不同组织来源的肿瘤时，Nrf2抑制剂可增强疗效。然而，在使用化疗药物治疗的患者中，同时服用Nrf2的特异性抑制剂对疗效有何种影响还有待动物和临床实验的验证［26］。另外值得注意的是，对于Nrf2诱导耐药性产生机制的研究还处于初级阶段，Nrf2调控下游基因表达导致耐药性产生的路径的研究较局限，抑制 Nrf2或激活/诱导Keap1的表达是否能够逆转耐药性尚不明确。

3.3 防止肿瘤形成 研究发现Nrf2-Keap1信号通路在很多肺癌癌组织和肺癌细胞株中都被削弱了［27-28］。推测这种削弱使Nrf2水平升高，继而转入细胞核增加其下游基因的表达，导致依赖Nrf2的防御性反应在这些癌组织和细胞株中被完全激活。这样，肿瘤细胞通过消除Keap1介导的对Nrf2的负性调控从而使自己获得有利生长的条件。Donnie等［31］从头颈部鳞状细胞癌的91.5%肿瘤组织中都发现Nrf2的过度表达有力地证明了上述假设。此外，基因突变也会发生在Nrf2的编码区，尤其是有吸烟史的癌症患者或鳞状细胞癌的患者［32］。这些突变破坏了Nrf2与Keap1的连接，使Nrf2表达失调进而导致了细胞中Nrf2强烈而持久的激活。这不仅给癌细胞的生存创造了有利条件，而且使癌细胞对抗癌药物产生抵抗作用，最终导致肿瘤的形成。

3.4 其他 敲除Keap1的小鼠发生后天性死亡，可能是由于食管和胃贲门处过度角化而导致的营养失调。推测这种情况可能是由于细胞核Nrf2的堆积，因为Nrf2的活性影响某些鳞状上皮基因的表达水平［33］。

4 结 语

Nrf2是内源性抗损伤系统的关键转录因子，Nrf2在细胞核内完成转录激活功能后及时转运出核降解与Nrf2在氧化应激条件下的激活同样重要。因此，越来越多的研究开始将方向转向对Nrf2的负性调控机制上。然而到目前为止，研究还存在很多不足之处。不同的研究团队提出了不同的Nrf2出核转运机制，其主要分歧点在于Nrf2是通过自身的NES介导转运出核还是通过Keap1介导转运出核。但是无论研究结果倾向于何种机制，其研究数据都不能完全否认其他出核转运机制的存在，因此推测可能同时存在多种转运机制调控Nrf2的出核转运。但何种转运机制占主导地位或何时占主导地位目前尚不明确。此外，虽然各种出核转运机制最终的生理意义相同，但是不同的机制将会导致实验或临床干预的靶点不同，所以进一步研究明确其具体机制具有重要意义。

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