PiggyBac转座子:人类基因编码研究的新工具

于正洪，姜恩泽，张杰明综述，陈龙邦审校

0 引 言

人类基因组有2层意义，即遗传信息和遗传物质。基因组(Genome)就是一个物种中所有基因的整体组成［1］。美国科学家于1985年率先提出了人类基因组计划，并于1990年正式启动该计划。这一预算达30亿美元的人类基因组计划由多国共同参与。这个计划原本设想在2005年全部解开人体内约10万余个基因密码，并获得组成人体4万个基因的30亿个碱基对的全部信息，同时绘制出人类基因的图谱。在完成了人类和鼠的基因组测序工作后，许多科学家开始把研究重心转向基因的功能研究，研究策略是诱使每个基因发生突变，并观测结果及分子机制。但能够用于哺乳动物的遗传分析方法有限，传统分析方法包括基因剔除、乙烷亚硝基脲化学诱变等花费大且效率低下，很难应用于基因功能的大规模分析。现有研究已经证明，转座子是多种生物中极为有价值的遗传工具，这种自然的基因转移因子不但可以抑制基因的活性，而且可以在果蝇或简单生物中插入或突变基因以了解单个基因的功能［1］。在低等生物实验中，转座子十分有效，且已被大规模地用于转基因和基因诱变分析，在酵母、线虫和果蝇等低等生物类模式生物的基因功能研究中起到了重要作用。然而，在过去由于缺少可在哺乳动物中高效作用的转座系统，在哺乳动物中的转座子运用仍极其有限。

1 转座子的作用机制

转座指一段DNA序列从原位上单独断裂或复制下来后环化插入另一位点，并对其后的基因起调控作用的过程。这段复制或断裂下来的DNA序列被称为跳跃基因或转座因子，包括转座子(Tn)、转座phage、插入序列(Is因子)等类型。基因组中一类可移动的DNA序列被称为转座子，转座子能够从原位切割断裂，再到新的目标位置重新整合，从而能够从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。这样的位置变换会改变原有基因的位置和结构，从而导致基因的改变，且转座子还有被置换及插入外来基因的能力。转座子转座插入宿主DNA时会在插入处留下正向重复序列，先是在目标DNA位置的插入处酶切出交错的切口，使目标DNA产生2个突出的单链末端，然后转座子同单链连接，使留下的缺口补平。这一系列过程在转座子插入处生成了宿主DNA 的正向重复［2］。

与简单的“插入序列”不同，转座子可以在宿主基因组中发生基因座位置改变，且不依赖于同源性重组的DNA片段，除能够携带行使本身转座功能的基因外，还能携带编码其他功能的基因，故可将其作为一种基因载体。依据序列特征及转座机制，转座子可分为逆转录转座子和DNA转座子2大类;逆转录转座子编码逆转录酶，将染色体DNA转录形成RNA并以此为模板，通过“拷贝-黏贴”机制进行转座，经逆转录酶作用重新合成DNA并插入到基因组中，引起稳定突变;DNA转座子编码转座酶一般直接通过“剪切-黏贴”机制转座，不形成RNA，也与逆转录酶的作用无关，引起不稳定突变［3］。目前应用于昆虫实验中的转座子几乎全部为DNA转座子，这类转座子末端为反向重复序列，中间区域为转座酶基因，此基因编码转座酶，使末端重复序列与其内侧的目标序列移动，即将目标序列部分切出，并将其整合到染色体的其他部位［4］，从而利用这类转座子进行转基因操作。在基因功能研究领域，目前以DNA转座子为基因载体，在基因组中引入突变和基因标签的技术已经逐渐得到广泛应用，并且有成为研究重点的趋势。近年来，在国内外研究学者的努力下，随着技术改良与新转座系统的建立，DNA转座子基因载体的适用范围已被拓展到寄生虫、鱼类和哺乳动物等模式动物的转基因研究中。

在运用上，转座子可以用于将基因整合到宿主细胞基因组中［4］。当转座子在转座过程中插入基因内部或是临近位置时，会对被插入基因造成基因功能的突变或失活，因而可以用以研究基因功能［5］。此外，转座子一个值得注意的特性是可以人为利用基因工程手段改造转座子，将转座识别序列和编码转座酶的序列分离，并在转座序列中插入外源目的基因。当转座酶与转座序列同时存在时方可发生转座。依此特性可建立二元转座系统，以提高转座的安全性［6］。

2 PB转座子系统的优势

长期以来，具有活性的转座子应用于哺乳动物的研究十分稀少。目前能在哺乳动物中使用的转座子包括hAT样转座子、Tcl样转座子、PB转座子家族，其中SB和PB活性最高［6－7］。然而，SB转座子在转座后会在供体处留下3个bp的足迹，并具有供体临近位置转座的偏好性。这些缺点使SB的使用受到限制。而PB不但转座活性相对更强，还不会在供体处留下基因足迹，不改变供体位置的遗传物质，因而备受关注［8］。在发现初期，PB转座子能成功地在地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕等昆虫中完成转座［9］。随着研究的深入，研究人员发现PB转座子同样可以在哺乳动物细胞中完成转座［10］。PB转座系统凭借其高活性、转座无痕性的特点，以及在哺乳动物中的转座活性，在分子医学领域表现出广阔的前景。

PB转座子为自主因子，能够将基因导入哺乳动物细胞，属于真核生物的第2类转座子。该转座元件最早被发现于变异的棒状病毒中，故得名PB。原始的PB元件有大约2400 bp，两端拥有13个碱基对的末端重复序列和19 bp的内部重复序列，可以将外源性的目的基因插入在PB元件的内部重复序列之间，使之成为载体。其他单独载体所表达的PB转座酶也可用来激活PB元件的转座活性，即转座酶和序列本身可以分开。这些特性使之能够将外源基因插入基因组的TTAA核苷酸序列中，如其他第2类转座子介导“剪切-黏贴”式的基因插入。由于PB转座子的转座频率较高，且能准确地在TTAA核苷酸序列目标位点处插入，故该转座子被归入特殊的TTAA转移因子家族。且PB介导的转座能够应用于人类细胞，这可能为癌基因测定与基因疗法提供条件。这种转座子适用范围较广，且能够在生物体染色体中准确地切出和转座，从而早期在鳞翅目等昆虫中可作为基因转移载体发挥作用［11］。

与果蝇转座子(P-转座子)类似，PB转座子也遵循“剪切-黏贴”式的转座机制。不仅如此，PB转座子还能在鳞翅目等多种昆虫基因组中的特征性核苷酸序列目标位点(TTAA序列)进行准确的切出和转座，与果蝇转座子(P-转座子)类似且切出和插入时均需要转座子本身编码的转座酶的作用。这些特点P-转座子不具备［12］。PB转座子在转座酶的作用下从供体染色体上切割断裂并游离出来，而被剪切的供体染色体则分裂为2段，DNA连接酶将分为2段的供体染色体的断端重新连接。目标染色体的特定位置(TTAA位点)被切开，末端为黏性末端。游离出来的PB转座子在自身编码转座酶的作用下与切开的目标染色体末端连接，并将末端补齐。这样在转移到目标染色体上的PB转座子两侧即出现了TTAA重复序列［13］。

作为一种新的基因诱变工具，PB拥有许多目前基因转移载体所不具备的优势。其构建过程更方便，也具有更高的安全性，且较其他转座子拥有更高的转座活性和更大的载体容量(可以容纳9100～14300 bp的序列)，并且能够实现无痕转座。与传统技术相比，PB转座系统是一种新的基因转移手段，具有以下的几项优势:①容易确定整合位点;②转基因得到长期稳定的表达;③转基因更易模拟内源基因的表达状况，以单拷贝形式整合;④在活体中跟踪转基因时，非损伤性的可见标记替代了传统的PCR等方法;⑤能同时携带多个基因的大片段DNA，有着较大的负载容量;⑥较高的整合效率［14］。

与病毒载体相比，PB还拥有以下优势:①PB转座系统可以用于基因捕获技术结合，配合表型分析获取内源基因的表达谱;②基因型鉴定的效率大大提高，成本得以降低，因其可以在交配过程中将遗传标记如荧光蛋白等引入，追踪转座子和转座酶的分布，利用报告基因(如红色荧光蛋白基因)可直接用肉眼区分纯合子和杂合子的PB插入情况;③PB插入能打断原有基因序列，从而破坏内源基因功能产生，且与传统基因剔除诱变类似的表型;④由于其剪切十分精确，PB可广泛插入基因组中，但有插入基因区的偏好;⑤PB可对突变表型的实现回复，能够进一步确定表型和基因型的对应关系;⑥能够在基因组中利用反向PCR确定PB的插入位置;⑦PB转座系统可在生殖细胞中高效运作，不需要胚胎干细胞培养、动物手术等基因剔除的传统诱变方法，仅需要简单的交配就可以快速而高效地生产大量携带有单个PB、且可稳定传代动物品系。由此可见，PB转座系统不仅是一种新的广泛应用于科学实验中的非病毒基因治疗载体，也是一种新的可用于哺乳动物和培养细胞的转基因工具［15］。

3 PB转座子的应用

3.1 作为基因转移载体 目前常用的基因转移载体有病毒、转座子等。PB是转座子系统中最适合嵌合转座的转座子。Kettlun等［16］将一个高度位点特异性的合成锌指结构DNA结构域整合在PB的转座酶N-末端，以完成PB转座子在人类细胞中的位点特异性基因组整合。将PB转座子与DNA序列识别结构组合可使PB转座子被用于特异性位点的转座。PB转座子的这一特性使之成为未来转基因实验的潜在工具。

此外，作为一种基因载体，PB的限制性相对较少，因而能够广泛应用于各种昆虫。目前已成功获得将PB作为转基因昆虫载体制取的转基因昆虫。鳞翅目昆虫家蚕是一种常用的实验动物，其生命周期短、饲养简单，不仅是生产中的一种重要的经济昆虫，在真核基因表达调控的实验中也是一种理想模式动物。通过使用PB这一理想转座系统，可将外源基因导入家蚕基因组，并保证外来性状的稳定获得、表达和遗传，从而使家蚕在作为生物反应器领域的作用得到更好的发挥［17］。PB转座子的发现和其在家蚕中的成功应用，为构建转基因家蚕、培育抗病毒的家蚕品种和分析家蚕基因功能等工作提供条件。

3.2 筛选新的癌基因 高等动物的基因功能分析由于缺乏必要的插入诱变工具而一直十分困难。逆转录病毒曾被用来发现癌基因，但仅能用于造血组织和乳腺等噬病毒性组织。之后发现的SB转座子可用于包括胚胎干细胞在内的多种细胞。而PB转座子拥有比SB转座子更高的容量，且没有邻近转座偏好，因而可成为更好的癌基因筛选工具。

将PB转座子插入可能的癌基因可有效诱发动物细胞癌变，以确定癌基因。Rad等［6］建立了表达PB转座酶小鼠和载有不同基因的多种PB转座序列。实验利用基因工程将PB嵌入小鼠基因组中，并使其在染色体基因上产生作用，从而引起一些致癌基因被破坏。研究人员分析实验小鼠中肿瘤的发展，找到基因组中转座子的分子印迹，分析并发现新的致癌基因。当研究人员利用PB系统在63个小鼠白血病样品中筛查癌基因时，分析72个基因组中转座子直接位点的工作中发现其中约2/5是从未发现过的新的基因位点。此外，该方法能够在特定的器官中开启或关闭特定的基因表达，从而便于基因组中癌基因的研究［6］。

在二元转座系统中，转座酶与转座序列位相互分离，但在双阳性小鼠体内，表达的转座酶依然可以催化转座序列的转座。该系统可在转座酶与转座序列共存的小鼠中诱发导入转座序列的癌基因所对应的癌症。同样，使用PB转座子破坏抑癌基因也可用于确定被转座破坏的序列在疾病发生机制中的作用。

3.3 用于哺乳动物基因功能的研究 人类的基因组中约有28000个基因编码蛋白质［16］。除此之外，还有很多同样行使重要功能的非编码RNA基因和DNA调控元件。针对所有这些基因组分的功能解读对于人类生物学及疾病的研究具有重大的理论指导意义和实际应用价值。小鼠和人有超过99%的基因同源。因此，在小鼠基因中进行遗传分析研究对于人类基因功能的测定和疾病相关基因的发现具有十分重大的意义。Sheng等［18］改造了PB系统，在体外培养的哺乳动物细胞和小鼠体内建立了PB转座介导的转基因方法，发现其能在小鼠体内高效转座，除能在体外培养的哺乳动物细胞中转座，研究利用PB转座介导的插入诱变结果在小鼠体内有效地破坏基因功能。研究者发现PB转座子在人和小鼠的细胞中都表现出高效的转座活性［18］。经过3个月的时间研究，初步确定了70多个陌生的小鼠基因的功能［17］。首个高效实用的哺乳动物转座子追踪系统的建立使得PB系统的转基因技术直接对小鼠的受精卵进行修改，而不需要进行干细胞培养。该系统的建立为大规模哺乳动物基因功能的测定指明方向，也为哺乳动物基因组水平的高效基因诱变提供重要工具。

3.4 在基因治疗中的作用 基因疗法的应用离不开能够高效而稳定地将遗传信息载入基因组的载体。目前大多数的基因插入使用病毒载体。然而，病毒载体具有许多缺陷，如病毒载体的容量极其有限，病毒感染会引起宿主免疫反应而需要空载病毒的对照，且病毒具有突变的风险。不仅如此，许多传统载体，如腺病毒，不能使目的基因长期表达。人们开始寻求新的替代基因载体以避免传统病毒载体的缺陷［19］。

PB染色体的卓越性能为研究提供了一个新的选择。其在人类细胞中的转座效率比同为转座子的SB更高，且不存在过量抑制现象［3］。潘雪珂等［20］利用PB转座子介导了外源性Rb基因转染视网膜母细胞瘤细胞，并观察到转染细胞与对照组的细胞活性与计数有统计学上的差异。Hideyuki等［21］在人类肝细胞系中使用PB进行了转录，并得到了长期基因表达。

相关的研究证明PB不仅可以用于癌症研究，也可以用于制备更安全的干细胞。加拿大与英国的一个联合研究组选择了一种PB转座子，其可携带基因在遗传密码中游走。PB转座系统可以作为载体搭载4种转录因子，而这4种转录因子(c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2)可诱导普通皮肤细胞的去分化及重编程，使其转变为iPS细胞，而且在成功构建诱导干细胞后还可再次使用PB转座系统消除诱导细胞重编程的4种植外源基因。这是首次在整个过程中将皮肤细胞转化为在形态和功能上与胚胎干细胞相似的iPS细胞而不使用病毒［21］。虽然在用于临床之前，该技术仍需进一步的研究，但该技术的实现仍然是医学研究的一个重大的进步，并可以作为进一步的干细胞分化研究的基础。

4 结 语

目前的实验结果已成为脊椎动物乃至哺乳动物中构建一个可以用于多功能遗传分析的高效转座系统关键的进展。PB系统的进一步研究和应用将对人类生物学的发展和疾病的研究有所裨益。随着PB转座系统广泛的得到应用，该技术将进一步推动哺乳动物基因功能检测的进程。由于PB转座子作为载体的限制性较少，该技术作为人类基因编码研究的新工具有着广阔的应用前景。

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