高糖对人晶状体上皮细胞硫醇转移酶表达的影响△

刘擎 杨烨 严宏

高糖对人晶状体上皮细胞硫醇转移酶表达的影响△

刘擎 杨烨 严宏

糖尿病性白内障；高糖；晶状体上皮细胞；硫醇转移酶

目的观察高浓度葡萄糖对人晶状体上皮细胞硫醇转移酶(thioltransferase，TTase)表达的影响。方法将体外培养的人晶状体上皮细胞分别用葡萄糖浓度为5.5 mmol·L-1(正常对照组)、15.5 mmol·L-1、25.5 mmol·L-1及35.5 mmol·L-1(不同浓度高糖组)，胎牛血清体积分数均为15%的DMEM培养液培养，同时设5.5 mmol·L-1葡萄糖+30.0 mmol·L-1甘露醇高渗对照组，24 h后Western-blotting检测TTase表达情况。选择35.5 mmol·L-1高糖浓度培养细胞，分别在0 h、2 h、8 h、16 h、24 h时间点收集细胞，Western-blotting检测TTase表达，并测定TTase活性，细胞内总谷胱甘肽(T-GSH)、还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，计算GSSG与T-GSH的比值。结果TTase表达随葡萄糖浓度增加逐渐增强，在35.5 mmol·L-1高糖组中表达最强，约为正常对照组的2.3倍(P<0.01)，25.5 mmol·L-1高糖组约为正常对照组1.7倍(P<0.05)，甘露醇高渗对照组TTase表达与正常对照组相比无明显变化(P>0.05)。在35.5 mmol·L-1高糖处理后2 h，TTase表达开始增高，8 h表达达到高峰，约为正常对照组的2.0倍(P<0.01)，随后逐渐下降，16 h时约为正常对照组1.7倍(P<0.01);24 h降为1.5倍(P<0.05)。与TTase表达类似，TTase活性在35.5 mmol·L-1高糖处理后2 h开始升高，8 h达到高峰，约为正常对照组的1.8倍(P<0.01)，随后逐渐下降。GSH在35.5 mmol·L-1高糖处理后16 h较对照组明显下降(P<0.05)。GSSG和GSSG/T-GSH比值在35.5 mmol·L-1高糖处理2 h后均显著升高，分别约为正常对照组的3.5倍(P<0.001)和3.3倍(P<0.001)，并随时间推移不断上升。结论高糖可诱导晶状体上皮细胞TTase表达上调、活性增强，同时伴GSH的含量下降，GSSG含量上升。

[眼科新进展，2014，34(3)：201-204]

硫醇转移酶(thioltransferase，TTase)又称谷氧还蛋白(glutaredoxin，GRx)，是一种广泛存在于动物各个组织细胞中的二硫化物还原酶，其主要作用是还原蛋白质与谷胱甘肽(glutathion,GSH)形成的二硫化物(PSSG)，调节细胞内巯基与二硫化物的比例，维持细胞内氧化还原状态的平衡。

糖尿病性白内障是糖尿病患者常见的并发症之一，其发病机制尚不明确，目前有三种学说来解释，即渗透压学说、蛋白质糖基化学说和氧化应激学说[1-4]，而氧化应激作为三个学说的中心环节倍受关注。作为体内重要的抗氧化修复酶，TTase在糖尿病性白内障发病机制中的作用如何？本实验初步观察了高糖引起的人晶状体上皮细胞氧化损伤过程中TTase的表达情况，为进一步研究糖尿病性白内障的发病机制打下基础。

1 材料与方法

1.1材料人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells B3,HLEC B3；第四军医大学西京医院眼科保存)胎牛血清；DMEM培养基，2.5 g·L-1胰蛋白酶(美国Gibco公司)；D-葡萄糖，GSH，β-NADPH，HEDS，谷胱甘肽还原酶(美国Sigma公司)；兔抗人TTase多克隆抗体，兔抗人β-actin多克隆抗体，HRP标记山羊抗兔IgG多克隆抗体(英国Abcam公司)；GSH和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)检测试剂盒，RIPA裂解液，BCA蛋白定量试剂盒，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术研究所)；ECL化学发光试剂盒(安美生物技术有限公司)。其余试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1细胞培养及高浓度葡萄糖的处理HLEC B3在含5.5 mmol·L-1葡萄糖，体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液中，37 ℃、体积分数5% CO2孵箱内常规培养。取对数生长期的细胞接种至6孔培养板中。正常对照组培养液葡萄糖浓度为5.5 mmol·L-1，高糖组培养液葡萄糖浓度分别设为15.5 mmol·L-1、25.5 mmol·L-1及35.5 mmol·L-1，同时设5.5 mmol·L-1葡萄糖+30.0 mmol·L-1甘露醇作为高渗对照组，培养液胎牛血清体积分数均为15%，6孔板低糖培养24 h后换不同浓度高糖及高渗培养液，24 h后收集细胞待测。

1.2.2Westernblotting检测TTase蛋白表达量对正常培养细胞换用35.5 mmol·L-1高糖培养液，分别于0 h、2 h、8 h、16 h、24 h收集细胞待测。将细胞用预冷的PBS洗涤3次，根据细胞生长密度每孔加入适量RIPA裂解液及PMSF，低温条件下裂解30 min后将细胞刮于一侧，用移液器将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL离心管中，4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min，BCA法测定上清液中总蛋白浓度，加上样缓冲液煮沸，按每孔100 μg上样，进行电泳、转膜，室温封闭2 h后根据不同目的条带加入抗TTase或抗β-actin抗体于4 ℃孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的二抗孵育1 h，ECL发光、显影。用Image J软件测定条带灰度值，TTase表达的变化以各组中相应条带的灰度值相对于β-actin的倍数表示。

1.2.3TTase活性测定GSSG在谷胱甘肽还原酶的催化下，由NADPH供氢，还原成GSH，NADPH因消耗而减少。采用Sigma公司的GSH、β-NADPH、HEDS、谷胱甘肽还原酶等生化试剂，通过分光光度计检测30 ℃条件下，1 min内NADPH在340 nm波长处吸光度值的降低情况，可用来表示TTase的活性，具体操作按照Raghavachari等[5]采用的方法。

1.2.4细胞GSH和GSSG含量测定将细胞用PBS洗涤1次，加适量PBS后将细胞刮下，离心后吸尽上清。加入细胞沉淀体积3.0倍量的蛋白去除试剂M溶液，充分混匀，然后利用液氮和37 ℃水浴对样品进行两次快速的冻融，离心取上清，按试剂盒说明书测定总GSH及GSSG，还原型GSH=总GSH-2×GSSG。

1.2.5统计学处理采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，多组间总体比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义，各实验均重复3次。

2 结果

2.1不同浓度葡萄糖干预对HLECTTase表达的影响经过24 h不同浓度的高糖培养液培养后收集细胞，Western blotting检测结果发现TTase表达随葡萄糖浓度增加逐渐增强，在35.5 mmol·L-1高糖组中最强，TTase表达量约为正常对照组的2.3倍(P<0.01)；25.5 mmol·L-1高糖组次之，TTase表达量约为正常对照组1.7倍(P<0.05)；15.5 mmol·L-1高糖组及高渗对照组与正常对照组相比TTase表达无明显变化(均为P>0.05，见图1)。

2.2高糖干预不同时间对HLECTTase蛋白表达和活性的影响正常低糖培养的细胞换35.5 mmol·L-1高糖培养2 h后TTase表达开始升高，8 h达到高峰，约为正常对照组的2.0倍(P<0.01)；随后逐渐下降，16 h时约为正常对照组的1.7倍(P<0.01)；经过24 h干预，TTase表达降为正常对照组1.5倍(P<0.05，见图2A)。TTase活性在高糖培养2 h后开始升高；8 h达到高峰，约为正常对照组的1.8倍(P<0.01)；随后逐渐下降，16 h时约为正常对照组的1.6倍(P<0.01)；24 h时降为正常对照组的1.5倍(P<0.01，见图2B)。

2.3高糖干预不同时间对HLECB3GSH与GSSG含量的影响正常低糖培养的细胞换35.5 mmol·L-1高糖培养，细胞GSH含量在高糖加入后随时间推移逐渐下降，从16 h后开始与正常对照组相比显著降低，约为正常对照组含量的71%(P<0.05)；24 h时约为正常对照组的67%(P<0.05，见图3A)。GSSG含量及GSSG/T-GSH在高糖干预2 h时分别约为对照组的3.5倍(P<0.001)和3.3倍(P<0.001)，随后一直处于较高水平，且呈逐渐上升趋势(图3B，见图3C)。

3 讨论

1974年Askelöf等[6]首次在大鼠肝组织中发现TTase，随后Holmgren等[7]在大肠杆菌中也发现TTase的存在。在哺乳动物中，TTase有两种同工酶，存在于细胞质的TTase-1和近年来发现的存在于线粒体中的TTase-2[8-9]。许多研究证明了TTase-1对维持细胞氧化还原状态的重要作用，而关于TTase-2的研究较少，其作用仍不清楚。1996年Raghavachari等[5]首次报道牛眼晶状体中存在TTase。随后在对人、鸡胚和大鼠等不同物种的比较研究中发现，不同物种晶状体中TTase的活性类似，且TTase在晶状体皮质和晶状体核中分布比较均匀，而晶状体上皮细胞中的TTase含量是皮质和核的3～4倍。晶状体上皮细胞位于晶状体前囊膜下，是晶状体的生发中心，也是抵抗外界刺激的中心和代谢最活跃的部位，对晶状体的生长发育、维持透明性和内环境稳定性具有十分重要的作用。由于晶状体长期处于各种内源性或外源性氧化因子的作用下，晶状体内的抗氧化系统对于防止白内障的发生起着关键的作用[10]。晶状体内高水平的GSH是抗氧化损伤重要的第一道防线，对抵抗活性氧和维持蛋白质的还原状态非常重要，第二道防线则是各种修复酶，TTase就是其中之一[11]。TTase在抵抗氧化应激，调节晶状体的氧化还原状态方面发挥着非常重要的作用。Löfgren等[12]研究发现TTase基因敲除鼠晶状体上皮细胞GSH水平降低，谷胱甘肽化蛋白质大量增加，细胞对H2O2的清除能力降低，而将重组人晶状体TTase导入细胞后，细胞抗氧化能力接近正常。糖尿病性白内障发病机制尚未明确，但氧化应激参与了其发病已得到了广泛的证实[13-14]。研究显示，糖尿病性白内障大鼠或2型糖尿病性白内障患者的晶状体或房水抗氧化水平如GSH、SOD和CAT含量明显低于对照组，脂质过氧化产物高于对照组[15]。作为体内重要的抗氧化修复酶，TTase是否参与了高糖诱导的氧化损伤的修复、发挥保护性作用尚未有研究报道。

本研究首先采用不同浓度葡萄糖干预离体培养的HLEC，发现TTase表达与葡萄糖浓度存在相关性，在一定范围内，葡萄糖浓度越高，TTase表达量越多。随后又观察了TTase的表达及其活性随高糖刺激时间变化的情况，在高糖干预早期TTase表达和活性迅速上调，而随着高糖持续时间增加逐渐下降。高糖引起细胞内重要的抗氧化物GSH含量降低，而GSSG与T-GSH的比值显著增加，随着高糖持续时间增加逐渐上升。Raghavachari等[5]报道了HLEC在给予0.1 mmol·L-1H2O2刺激后，TTase在10 min时表达增加了近2倍，60 min时恢复到基线水平，TTase活性变化与其表达情况类似，活性在10 min时达到高峰，60 min时恢复至基线水平。Bhuyan等[16]对氧化应激诱导白内障小鼠模型的研究发现，3周后与TTase类似的另一种抗氧化修复酶硫氧还蛋白表达上调了5倍，然后逐渐下降。这些变化可能是机体对早期氧化应激的一种反应性保护作用。本实验中，TTase的表达与活性随高糖刺激时间变化趋势与这些报道类似，我们推测高糖干预晶状体上皮细胞早期TTase表达迅速上调，活性增强，可能是细胞对抗高糖诱导的氧化应激的一种自我保护机制，而随着应激持续时间增加，GSH等抗氧化物质的不断消耗，当TTase的表达上调不足以抵抗氧化损伤时，其表达与活性逐渐下降，细胞内正常的氧化还原平衡状态被打破，若高糖刺激持续存在，细胞内大量蛋白相互交联形成二硫化物，这些二硫化物的聚集，最终导致晶状体由透明变为混浊，形成白内障。

综上所述，高糖可诱导晶状体上皮细胞TTase表达上调，活性增强，同时伴GSH的含量下降，GSSG含量上升。TTase可能在糖尿病性白内障形成中发挥保护性作用，但其作用及调控机制还有待深入研究。

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date：Nov 26，2013

National Natural Science Foundation of China(No：81070720)From theDepartmentofOphthalmology，TangduHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710038，ShaanxiProvince，China

Effects of high glucose on thioltransferase expression in human lens epithelial cells

LIU Qing，YANG Ye，YAN Hong

diabetic cataract；high glucose；lens epithelial cells；thioltransferase

ObjectiveTo observe the effects of high glucose on thioltransferase(TTase) expression in human lens epithelial cells.MethodsHuman lens epithelial cells B3(HLEC B3) were cultured in DMEM containing 15% fetal bovine serum and exposed to 5.5 mmol·L-1glucose(control group)，15.5 mmol·L-1，25.5 mmol·L-1，35.5 mmol·L-1high glucose groups and mannitol control group.After 24 hours，incubation cells were gathered and TTase expression was examined by Western blotting.Cells were then gathered at 0，2 hours，8 hours，16 hours and 24 hours after incubation with 35.5 mmol·L-1high glucose，respectively.TTase expression and its activity were examined and the levels of T-GSH，GSH and GSSG of HLEC B3 were measured.GSSG/T-GSH ratio was calculated.ResultsWith the raise of the concentration of high glucose，the expression of TTase increased gradually and the maximum expression appeared in 35.5 mmol·L-1group，almost 2.3 times to the control group(P<0.01).No changes was observed in the mannitol control group(P>0.05).The expression of TTase increased after treated with high glucose of 35.5 mmol·L-1for 2 hours and reached the top for 8 hours，nearly 2.0 times to control group(P<0.01) and then decreased gradually.Similarly，TTase activity in 35.5 mmol·L-1group increased from 2 hours，reached at 8 hours，nearly 1.8 times to control group(P<0.01)，then decreased gradually.The level of GSH decreased after treated with 35.5 mmol·L-1glucose and was significantly lower at 16 hours than control group(P<0.05).The level of GSSG and the ratio of GSSG/T-GSH increased significantly after 2 hours incubation with 35.5 mmol·L-1glucose，nearly 3.5 times(P<0.001) and 3.3 times(P<0.001) to the control group，respectively，and continued to elevate with time.ConclusionThe expression and activity of TTase in HLE cells increase after treatment with high glucose，in which the GSH level decrease and GSSG level increase.

刘擎，男，1987年5月出生，在读硕士研究生。联系电话：029-84777445；E-mail：chinaliuqing@163.com

AboutLIUQing：Male，born in May，1987.Postgraduate student.Tel：+86-29-84777445；E-mail：chinaliuqing@163.com

2013-11-26

国家自然科学基金资助(编号：81070720)

710038 陕西省西安市，第四军医大学唐都医院眼科

严宏，E-mail：yhongb@fmmu.edu.cn

刘擎,杨烨,严宏.高糖对人晶状体上皮细胞硫醇转移酶表达的影响[J].眼科新进展,2014,34(3):201-204.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0053

修回日期：2013-12-16

本文编辑：董建军

Accepteddate：Dec 16，2013

Responsibleauthor：YAN Hong，E-mail：yhongb@fmmu.edu.cn

[RecAdvOphthalmol，2014，34(3)：201-204]