一氧化碳与移植器官缺血/再灌注损伤

张金敏，张松林(综述)，魏 蕾(审校)

(1.三峡大学心血管病研究所 宜昌市中心人民医院心胸外科，湖北 宜昌 443003; 2.武汉大学医学院病理生理教研室，武汉 430071)

缺血/再灌注损伤是临床器官移植最常见的病理过程，是导致同种移植物术后早期功能不全的主要原因和晚期并发症(如移植物血管病变)的主要相关因素[1]。尤其在目前供体不足的情况下，较多的利用受到不同程度的损伤甚至是非心跳的供体器官，更易受到缺血/再灌注损伤的影响。因此，寻找一种有效的减轻缺血/再灌注损伤的治疗方法是移植领域研究的方向之一。Smith等[2]在1992年意外发现以一氧化碳(carbon monoxide,CO)中毒患者为供体来源的心脏移植，术后排斥反应轻，移植物功能较好。由于CO的毒性，直到后来发现源于血红素加氧酶(heme oxygenase,HO)催化亚铁血红素降解产生的内源性CO，它的生理作用才得到重视。CO是一种与一氧化氮类似的气体信号分子，在调节血管张力、细胞生长与应急等方面发挥关键性作用。近年来，有学者把外源性CO用于器官移植研究，发现其与HO-1有类似的作用，可以明显减轻器官移植物缺血/再灌注损伤，并探明了部分机制。

1 CO具有改善微循环的作用

微循环紊乱是器官移植物缺血/再灌注损伤的特征性表现之一。移植物冷保存期间的缺血缺氧导致血管内皮通透性和黏附分子表达的增加，内皮细胞失去其抗黏附的特性并形成易于黏附的表面。移植恢复血流后，缺血受损的内皮细胞黏附血小板和白细胞，释放细胞因子和缩血管物质，进一步加剧炎性反应和内皮细胞的通透性，增加血管阻力而导致微循环紊乱[3]。研究表明，CO可以通过保护血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)、调节血管张力和抗凝作用来改善器官移植物缺血/再灌注损伤后的微循环紊乱[3]。

1.1CO保护VECs VECs是缺血/再灌注损伤的主要作用靶区，其损伤可导致器官移植物的微循环紊乱和炎症级联反应的激活。在形态学上，冷保存再灌注后损伤的VECs表现为移植物内毛细血管内皮细胞标志物CD31的表达明显减少，并出现不规则和中断现象；扫描电镜显示VECs有较多空泡形成和线粒体的破坏；而受体吸入CO组(250×10-6kg/L)却发现毛细血管CD31着色的VECs呈线型排列，细胞间的结构保存完好；透射电镜三维显像示毛细血管呈网络状排列和较好的充盈状态，近似正常组织的超微结构[4-5]。这提示CO可以通过保存VECs的形态结构完整性来减轻移植物缺血/再灌注损伤。

资料表明，损伤的VECs可以上调黏附分子的表达，如细胞黏附分子1、血管细胞黏附分子1、P选择素等，从而促进VECs与白细胞和血小板的黏附，导致微循环的紊乱和移植物损伤[3]。因此，抑制黏附分子的表达将有助于缓解移植物缺血/再灌注损伤。这在大鼠肾移植与肺移植实验中得到证实，吸入CO可以显著降低再灌注后移植物内细胞黏附分子1 mRNA的表达[4-5]，减少白细胞的黏附和浸润。

在体外细胞培养的实验中，同样证实了CO对VECs的保护性影响。Brouard等[6]的研究显示，外源性CO(10000×10-6kg/L)明显阻止肿瘤坏死因子α诱导的VECs凋亡，其保护机制与p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)的活化有关，使用p38 MAPK抑制剂(SB203580)可以逆转CO的保护性影响[6]；Caumartin等[7]亦证实，CO释放分子2预处理人脐静脉内皮细胞，可以明显减轻其缺氧/再氧化损伤，并证实与CO的抗炎作用有关。

1.2CO调节血管张力 微循环紊乱的另一特点是移植物缺血或再灌注后血管灌注压明显升高。损伤的VECs释放缩血管物质内皮缩血管肽1，导致血管阻力增加。研究表明，CO可以抑制人肺动脉VECs和血管平滑肌细胞内皮缩血管肽1的表达[6]。动物实验中，受体吸入CO(250 ×10-6kg/L)可以明显阻止心脏移植后内皮缩血管肽1的激活，并改善移植物功能[8]。这证实了CO可以通过抑制缩血管物质的表达而发挥其扩血管功能。

此外，可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)的活化及其伴随的环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)产生在CO调节血管张力中起关键作用。cGMP可以激活其下游的cGMP效应蛋白，如蛋白激酶，从而导致血管平滑肌松弛。由于外源性CO可以明显提高细胞内cGMP的浓度，可以认为CO的舒血管功能至少部分是cGMP依赖性的。在肺、肾移植的动物实验中，受体给入CO(250×10-6kg/L)或CO释放分子预处理可以明显改善移植物内的血流[3,9]，而CO的这种有益影响可以被sGC的选择性抑制剂所逆转，这间接地证实sGC/cGMP途径介导了CO的舒血管作用。

1.3CO具有抗凝作用 血小板在器官移植物缺血/再灌注损伤的发病机制起重要作用，它激活后可以分泌促凝物质(如血栓素A2)，导致微循环内血细胞黏附、纤维素沉积和血栓形成。CO具有强大的抗凝功能，能抑制血小板释放血栓素。在热缺血/再灌注肺损伤模型中，吸入CO明显抑制纤溶酶原活化因子抑制剂1的表达，减少微血管内的纤维素沉积[10-11]。Mishra等[11]在大鼠同系肺移植实验中观察到，CO不仅能减少纤维素和白细胞沉积，还明显抑制细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的活性和促凝激活剂早期生长反应因子1的表达。但抑制sGC的活性可以抵消CO的这种保护性影响，提示CO的抗凝功能也可能是经sGC/cGMP途径介导的[10-11]。此外，CO也可经激活糖蛋白Ibα介导的机制抑制血小板凝集和白细胞黏附，从而改善微循环。

2 CO具有强大的抗炎症特性

炎症免疫反应是器官移植物缺血/再灌注损伤的最主要的特征。损伤的组织细胞释放促炎细胞因子、趋化因子、黏附分子和各种酶类物质，移植物内伴有中性粒细胞、巨噬细胞甚至T淋巴细胞浸润。已经证明，CO对各种损伤均具有抗炎作用[3]。CO不仅可以保护脂多糖诱导的组织炎症损伤和下调众多促炎因子的表达(如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6等)，且对移植物缺血/再灌注损伤也显示出强大的抗炎功能。在一系列的动物移植模型中，受体在移植前1 h和移植后24 h持续吸入低浓度的CO(250×10-6kg/L)，可以明显减轻冷保存再灌注后肾、心脏、肺和肝脏移植物内的炎性细胞浸润[7,9,12-15]。其机制与CO下调促炎介质(如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、诱生型一氧化氮合酶、环氧合酶2等)的表达密切相关。

另有研究表明，核因子κB作为参与炎性反应的一个重要信号转导分子，调节许多炎症基因的表达，在诱导不同的器官移植物缺血/再灌注炎症损伤中起重要作用[3]。在肝、肺移植动物研究中，均发现核因子κB在移植血流恢复后迅速激活，而CO可以明显减少炎性因子的表达和减轻移植物的损伤程度，但核因子κB的活性无明显变化[3,5,10]。相反的是，低浓度CO能抑制脂多糖诱导的巨噬细胞粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的产生，其机制与CO抑制核因子κB的激活有关[16]。因此，核因子κB途径是否介导了CO对器官移植物缺血/再灌注炎症损伤的保护性影响，目前仍有争议。

此外，MAPK可能是移植物缺血/再灌注炎症损伤的另一重要信号转导途径。MAPK主要包括p38MAPK、ERK、c-Jun氨基端激酶三个家族，与多种炎症性疾病有关。研究显示，CO的抗炎特性与MAPK激活有关，如CO能选择性地激活p38MAPK和其上游的MAPK激酶，从而保护人肺上皮细胞的氧化损伤[6]。在大鼠同系肺、肝脏移植模型中，冷保存再灌注后移植物内MAPK的三种激酶明显激活，吸入低浓度CO[(20～250)×10-6kg/L]明显改善移植肺的氧合功能，下调促炎细胞因子的表达，且证实CO的这种保护性影响与抑制ERK1/2的激活有关[10,15]，而CO并未抑制p38MAPK或c-Jun氨基端激酶的活性。

3 CO抑制树突状细胞的成熟与迁徙

近年来的研究表明，树突状细胞(dendritic cell，DC)在缺血/再灌注损伤中也起重要作用。损伤细胞释放内源性配体与DC上的Toll样受体结合，通过一系列蛋白质级联反应，导致促炎性细胞因子的释放，如白细胞介素12、干扰素γ、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α等，从而损伤缺血/再灌注器官。目前，在移植背景中探讨CO与DC关系的研究极少。Kotsch等[17]在一组同种大鼠肾移植研究中，用CO的前体药物二氯甲烷预处理供体，移植后与对照组比较，发现受体脾脏主要组织相容性抗原Ⅱ、CD80、CD86等分子的表达明显减少，同时趋化因子干扰素诱导蛋白10的表达亦显著减少，而移植物内上述分子无明显变化。这提示CO预处理供体可以抑制移植物DC的成熟和迁徙，降低移植物的免疫原性，减轻器官移植物的缺血/再灌注损伤。但CO调节DC的具体机制仍有待阐明。

4 CO具有抗凋亡作用

凋亡是器官移植物冷保存再灌注后常见的病理生理现象。业已证明，抑制细胞死亡信号通路是阻止器官移植物缺血/再灌注损伤的重要策略[3]，而凋亡细胞死亡又是促发炎症和组织损伤的关键因素，这提示凋亡在移植物缺血/再灌注损伤和功能不全中起重要作用。

前已述及，CO可以通过激活p38MAPK抑制肿瘤坏死因子α诱导的VECs凋亡[6]。在移植背景中，CO可以经不同的信号机制，同样显示出抗凋亡功能。Neto等[4]在大鼠肾冷保存24 h后移植的模型中发现，胱天蛋白酶3(caspase-3)阳性着色主要位于肾小管上皮细胞和管腔的细胞或碎片，移植后6 h阳性着色细胞数达最多，而受体吸入CO(250×10-6kg/L)则明显减少肾小管caspase-3阳性细胞的凋亡数(峰值<50%)。同样，在器官保存液中加入CO释放分子3，能明显抑制低温诱导的肾小球和肾小管细胞凋亡，并改善移植肾脏功能，其抗凋亡功能与CO稳定线粒体膜有关[18-19]。此外，采用二氯甲烷诱导受体小鼠产生CO，发现能明显减轻移植诱导的缺血/再灌注损伤，移植心脏再灌注后凋亡细胞明显减少，并证实CO的这种保护性影响与抑制促凋亡基因Bcl-2 mRNA和caspase-3的表达有关[20]。

目前，CO的抗凋亡影响在细胞模型和在体动物中均得到证实。但是，它对器官移植物缺血/再灌注损伤的保护作用是否主要通过抑制细胞凋亡实现的，目前仍不清楚。因此，关于凋亡在缺血/再灌注损伤中的具体作用以及CO在缺血/再灌注损伤中抗凋亡的信号机制，都有待于深入研究。

5 小 结

在各种动物移植模型的研究中，CO可通过改善微循环、抗炎作用、抑制DC成熟与迁徙、抑制凋亡等机制，明显减轻器官移植物缺血/再灌注损伤。此外，CO可应用于边缘性供体、已切除的移植物及受体，符合独特的移植环境，是最有希望用于临床移植的方法之一。但目前临床应用CO的研究较少，且部分结果与动物实验研究结果并不一致，这可能与外源性CO作用的不同模型、持续时间、吸入浓度以及作用的靶组织和靶细胞的差异性有关。此外，尚需进一步研究CO保护器官移植物相关机制并深入探讨CO的毒性、药动学及其生物学功能，以利于把这些研究成果应用于临床。

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