MicroRNAs在早期胚胎发育中的研究进展

江胜林综述，凌秀凤，张军强审校

0 引 言

蛋白质一直在基因表达过程中起主要的调控作用，RNA处于不显要地位。然而，后来人们发现原核生物中，RNA能通过碱基配对的方式抑制操纵子的表达。既之，又发现RNA还能在mRNA前体加工和蛋白质合成过程中具有催化功能，于是使RNA在细胞中所具备的功能被进一步拓展开来。1993年线虫的发育调控中的第1个microRNA(1in-4)被发现后，原来有很多既往看似不重要的非编码RNA参与了生命活动过程［1］，为我们进一步探索生命的奥秘，打开了一扇新的通道［2］。

1 microRNAs合成和作用机制

microRNA基因经过转录和内含子的剪接后，形成成熟的microRNA。microRNA经典的生物合成途径是microRNA经RNA聚合酶Ⅱ或者RNA聚合酶Ⅲ转录形成具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(poly A)的原始microRNA(pri-microRNA)，pri-microRNA再经核糖核酸酶ⅢDrosha(RNaseⅢDrosha)和其辅助因子Pasha/DGCR8(一种双链RNA结合蛋白)结合形成的微处理器蛋白复合体处理，再形成长约70个核苷酸、具有发夹结构的前体microRNA(premicroRNA)。然后在转运蛋白Exporti-n5的作用下进入细胞质，被胞浆中的RNaseⅢDicer剪切成约22个核苷酸长度的双螺旋链microRNA分子。双螺旋结构解旋，其中一条链被降解，另一条成熟的microRNA以完全或不完全配对方式结合到与其互补的mRNA靶位，进入RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，从而达到抑制蛋白的翻译或者降解mRNA的目的。还有少数microRNA反而能激活翻译［3］。除此外，Wu 等［4］提出microRNA可能还有另外一种调控机制，即对哺乳动物细胞的靶mRNA有脱腺苷作用。Bartel D P曾对microRNA在基因组、生物合成、作用机制以及功能等方面做了很好的总结［5］。

2 microRNAs在植入前胚胎的表达

哺乳动物受精后到植入前的胚胎发育是一个极其复杂的过程，包括受精卵的分裂、紧密态、桑椹胚和囊胚的形成。现阶段已有大量的研究证明，microRNAs在早期胚胎细胞增殖分化的过程中，表现出明显的时空特异性。张平和王颖［6］通过芯片分析和RT-PCR等方法在小鼠的卵母细胞、2细胞期、8细胞期和囊胚期筛查到近百个特异性表达的microRNAs，如miR-295在8细胞期以后表达呈渐升趋势;而miR-125a在卵母细胞到2细胞期阶段下降，以后逐渐上升。Argonaute(Ago)是一类庞大的蛋白质家族，是组成RISCs复合物的主要成员。含多个结构域，能准确识别出小RNA向导链，从而导致目标mRNA的切割或者翻译的抑制。Garcia-Lopez J 和 del Mao J［7］发现小鼠除了 Ago1、Ago3、Ago4 在2细胞期以及Ago2在4、8细胞期不明显外，Drosha酶、Dgcr8、Exportin5、Dicer、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4和Ago5基因都是从卵裂期开始下降。表明在受精后至植入前经典的microRNA通路都是下降的，同时囊胚期的miR-292-3P和miR-292-5P可作为体内潜在的 microRNAs库存。2013年，Maraghechi等［8］在兔的早期胚胎和胚胎干细胞样细胞中发现了特异表达的 OCU-miR-302和 OCU-miR-290家族，OCU-miR-302从早期囊胚表达持续至ES样细胞;与此相反，OCU-miR-290集群在早期胚胎发育过程中较高，在兔ES样细胞的表达水平却很低。据此推测OCU-miR-302集群可能是兔ES样细胞中与多能性密切相关的microRNA，而OCU-miR-290集群则在早期胚胎发育中起到至关重要的作用。

在胚胎事件发育进程中，与发育相关的microRNAs表现出特异的表达趋势，或升高、或降低，从而发挥独特的影响胚胎发育的角色。胚胎发育本身是一个连续不断的过程，伴随着细胞和组织渐进性的结构和机能变化。即使是同一时期，microRNAs也有不同的空间表达差异。受精卵经过6次卵裂后形成囊胚，囊胚腔内的细胞继续分化，分为胚泡腔、内细胞群(inner cell mess，ICM)和外滋养层(trophectoderm，TE)，其中内细胞群具有全能性，能分化发育成完整的个体。Goossens等则通过整体原位杂交和定量RT-PCR分析了牛囊胚期的ICM和TE的microRNA水平，发现ICM中的bta-miR-155是TE表达量的50倍［9］。Rosenbluth等从捐赠的人类胚胎中检测到了microRNAs的差异表达，其中整倍体中miR-372的表达量较非整倍体显著增加，这种明显的差异表达，可能对囊胚的存活很关键，可能是胚胎最终发育结局或其相关机制的早期暗示［10］。

以上提示我们，小鼠、牛、兔和人类的植入前胚胎的microRNAs表达均具有时间和空间动态性，且不同的物种具有不同的表达模式。因此，microRNAs在早期胚胎发育过程中可能发挥重要的作用。

3 microRNAs在早期胚胎发育过程中的作用

Zondag等［11］通过microRNA测序，发现在蜜蜂早期胚胎中28%的microRNA都有表达，并且和果蝇一样有明显的表达差异。敲除Dicer酶的蜜蜂发育有缺陷，提示蜜蜂的早期胚胎发育可能受到了microRNA的作用。同样，Blakaj也推测如果缺失了合成成熟microRNAs所必需的酶(Dicer或DGCR8)，小鼠早期胚胎发育就会阻滞，多能干细胞增殖和分化也会受到影响［12］。

改变了成熟microRNA的量，胚胎的发育就受到明显的阻滞。反之，人们又构造了发育阻滞的早期胚胎模型，去监测这些发育异常的胚胎的microRNA表达量的变化，得出了相同的结论。Zhang等［13］将斑马鱼胚胎暴露于可导致发育毒性的全氟辛烷磺酸或二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，与未暴露组对比，利用基因芯片对已知斑马鱼的219个microRNA的表达谱进行分析，并用实时定量聚合酶链反应来验证microRNA表达微阵列数据。最终，暴露全氟辛烷磺酸或DMSO后microRNA表达谱有显著变化。受精后24h和120h，分别有39个和81个microRNA在暴露全氟辛烷磺酸后表达模式发生了明显改变。受精后24h有20个基因显著上调，19个明显下降，而在受精后120h有41个显著上调，40个明显下调。胚胎接受全氟辛烷磺酸或DMSO暴露，引起了microRNA的一系列表达改变，并可能导致发育毒性。Mondou等［14］通过基因芯片筛选出牛的植入前早期胚胎的有表达差异的特异microRNA，并选取其中有表达差异的miR-21和miR-130a对牛的卵泡期、分裂期、2细胞期、4细胞期、8细胞期及囊胚期胚胎半定量PCR分析，发现成熟的miR-21、miR-130a和miR-130a前体呈线性增加。在2细胞阶段对胚胎暴露鹅膏蕈碱后，miR-21、premiR-21和miR-130a显著减少，提示microRNAs可能对牛的胚胎的早期发育起着调节作用，从而影响到母源基因向胚胎的过渡。

发育异常的早期胚胎，microRNA的量的改变，提示两者可能有明显的相互关系。金孝华等进一步深入研究发现miR-21在大鼠胚胎植入期的表达增加，推测miR-21的表达增加可能有利于胚胎植入的发生［15］。以上对斑马鱼、蜜蜂、鼠类、牛等动物的研究，无论从干预microRNA表达到影响胚胎的发育，还是发育异常胚胎中microRNA的改变，均提示microRNAs在动物早期胚胎发育过程中可能起了十分重要的作用。

4 microRNAs在早期胚胎发育中的调控机制和相关的靶基因

目前，microRNAs在早期胚胎发育过程中的作用机制尚不明了。对microRNAs作用机制的探究，主要是通过预测相关的靶基因，并进一步验证。Tripurani等［16］验证了牛的早期胚胎中miR-196a在4细胞和8细胞期时表达水平增高，且能负调节NOBOX基因(newborn ovary homeobox gene)。NOBOX作为一种转录因子，对早期胚胎发育的母体效应起重要作用，有研究已证实其与小鼠不育密切相关［17］。这意味着NOBOX在发育过程中可能降解母源性转录物，同样的情况也可在斑马鱼miR-430、非洲爪蟾miR-427和小鼠miR-290上观察到，揭示了早期发育中microRNA诱导母源性mRNAs的清除可能是普遍存在的一种机制［18］。Pang等［19］证明了 Siah1a的表达模式与miR-135a呈负相关，显微注射miR-135a的抑制剂，超过30%以上的受精卵的第1次分裂被抑制。进一步对注射了miR-135a抑制剂的小鼠同时注射 Siah1a特异性抗体，一定程度上抵消了miR-135a的抑制作用。因此，miR-135a可能是通过调节Siah1a的表达，来调节合子的第1次细胞分裂，参与蛋白酶体降解的调控。

microRNAs在着床前胚胎的表观调控途径中也可能起到一定的作用。Takada等［20］通过m-RAP分析发现，miR-29b可能通过作用于Dnmt3a和 Dnmt3b，调控小鼠原生殖细胞基因组甲基化，从而在雌性性腺发育过程中发挥重要作用。近期Lee等［21］研究得出结论在小鼠桑椹胚向囊胚过渡过程中microRNAs受DNA甲基化影响。该实验用DNA甲基转移酶抑制剂对胚胎进行处理后，通过实时定量PCR分析发现，桑椹胚向囊胚的发育被抑制，microRNAs基因中总共有48个下调、17个上调，包括 let-7e，miR-20a，miR-21，miR-34b，miR-128b 和miR-452等，并最后证实了8个以上可能作用的靶基因。

Wong［22］发现 miR-125b 能抑制 Nanog 和 Oct4的表达，抑制人类胚胎干细胞多能性，参与早期胚胎事件，促进中胚层分化。LEE等［23］研究结果明确提示miR-124a通过下调SLUG和IQGAP1的表达，抑制胚胎干细胞向原肠胚形成，从而保持干细胞特性。Foshay发现miR-17家族在哺乳动物的早期发育中表达，且能通过调节体内已知的干细胞调节器STAT3来参与干细胞分化，促进或降低胚层分化［24］。Colas等［25］筛选了小鼠全基因组的 microRNA，发现let-7和miR-18在早期胚胎过程中胚层形成起调节作用，两者是直接作用于Acvr1b和Smad2的3'-UTR。可见microRNAs在早期胚胎的胚层分化过程中，也起了不小的作用。Lu等［26］通过将胚胎的培养外环境HCO3-浓度降低，或者抑制囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)后，发现 miR-125b的表达水平下降，下游的P53上升，细胞生命周期受到影响，从而影响了胚胎的发育。Byrne等比较了Ped基因阴性(B6K1)和阳性(B6K2)的鼠胚胎各个时期miR-125a的表达，发现Ped基因阴性小鼠的囊胚期miR-125a水平10倍高于阳性小鼠，提示Ped基因可能是通过调控miR-125a的表达途径，来调节早期胚胎发育［27］。

Liu等［28］筛选出休眠和激活的小鼠囊胚的238个microRNAs中有45个表达差异。增加小鼠囊胚期let-7a的表达后，体内植入率下降，体外囊胚着床和生长均受影响。过表达与植入相关的分子Integrinbeta3后，let-7a的作用可被抑制，let-7a可能通过调节Integrin-beta3来参与植入过程。

综上所述，microRNAs可能通过降解母源性mRNA、抑制合子有丝分裂、表观调控机制等调节胚层分化、影响植入等环节，通过作用于相关的靶基因，在早期胚胎事件中发挥微妙而独特的生理作用。相关复杂的调控机制还需要进一步的探索。

5 展 望

目前根据microRNA可能的作用机制，对于microRNA在胚胎中的研究大致有2种思路［29］:一是通过突变生物体，如microRNAs生成所必需的酶突变或缺失时来验证microRNA在早期胚胎发育中的正常作用。二是对于人类等大型哺乳动物，选择基因芯片和/或生物信息学从胚胎或干细胞对比筛选出特异性microRNAs，过表达或抑制特异性microRNAs，分析其在胚胎干细胞中的功能［14］。具体的技术方法主要有:①直接克隆和测序列;②借助计算机和数据库，microRNA芯片对基因组的生物信息学搜索;③Northern杂交和原位杂交等方法;④靶向抑制基因序列的人工构建的内含子iRNA;⑤TaqMan探针法进行实时定量 PCR［30］。

microRNAs除了在早期胚胎发育过程中起重要作用外，在肿瘤细胞、心肌细胞、神经细胞的分化等方面也起到重要作用［31－32］。参与生物体生长发育和细胞分化调控的研究，为我们了解生物的正常成长及疾病的发生诊断提供了强有力的工具和全新的思维。然而，目前已被验证的并且功能明确的microRNA的数量还是甚少，其在各种生命活动中所扮演的角色尚未完全明确。随着研究的深入，microRNA研究中还存在一些需要解决的问题:如靶基因的预测和确定;调控microRNA表达的相关因子的鉴定;某个microRNA的准确表达时间的测定;以及众多microRNA如何整合为一个复杂庞大的分子网络等。正确认识和掌握microRNA在早期胚胎发育过程中的作用和机制，对于提高人类辅助生殖技术的成功率以及降低流产率，可以提供新的临床思路。

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