FH基因在遗传性平滑肌瘤病及肾癌综合征中的研究进展

周婷婷(综述)，邢金春(审校)

(福建医科大学第一临床医学院，福州 350004)

遗传性平滑肌瘤及肾细胞癌(hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer，HLRCC)综合征是一种不同于普通家族性的肾癌[如Von Hippel-Lindau综合征(VHL)、遗传性乳头状肾癌]，是孤立及单侧出现在肾脏的肾肿瘤，并普遍发生皮肤及子宫平滑肌瘤，其肾肿瘤比其他类型的家族性肾癌更具侵袭性[1]。HLRCC临床表现的基因外显率低于皮肤及子宫的病变，仅有少一部分进展为肾癌[2]。该文就延胡索酸水化酶(fumarate hydratase，FH)基因在HLRCC综合中的研究。

1 HLRCC的发病机制

1.1延胡索酸水化酶基因 HLRCC基因位点定位于染色体1q42.3～q43，即为目前大量证实的FH基因，其被定义为肿瘤抑制基因，大小约22 kb，含10个外显子，在物种间呈高度保守，1q32和1q42～43杂合性缺失突变[3]。FH基因产物为FH(反丁烯二酸酶)，亦称延胡索酸水化酶(fumarate hydra-tase)，是催化延胡索酸+H2O→L-苹果酸可逆进行相互转变反应的关键酶。FH基因失活突变导致细胞内延胡索酸水平异常升高。有研究证明，延胡索酸可结合并抑制EGLN(egg-laying nine，Fe2+和酮戊二酸依赖的双加氧超家族基因)/脯氨酸羟化酶(prolyl hydroylase，PHD)活性[4]。FH基因在生殖细胞的两个等位基因的突变会造成一种隐性遗传病，由于突变使机体所有组织中此酶缺少或活性下降，导致延胡索酸尿以及神经损害、肌张力减退、癫痫、面部和大脑先天性畸形等临床表现；然而杂合子的双亲是神经系统无症状的基因突变的携带者。突变使酶活性降低，其肿瘤易患因素与HLRCC相似[5]。

1.2低氧诱导因子——低氧环境下的转录活化因子 低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)归属于PAS(Per-ARNT-Sim)家族，是以螺旋-环-螺旋为基础的异构转录因子，由对氧敏感的α亚单位和结构表达型β单位构成，随细胞氧水平变化应答。HIF至今发现3个同源型家族成员，即HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α。HIF-1α基因位于染色体14q21～q24，β亚单位基因位于染色体1q21。HIF-1α在所有组织中均有表达，HIF-2α的表达受限且仅在某些组织(如肝细胞、神经胶质细胞和内皮细胞)中表达。在正常氧条件下，HIF在大多数细胞低水平表达。低氧环境下，HIF-α与HIF-β异源二聚化形成功能转录因子(其主要受HIF-α亚基的数量变化调节及激活)，HIF的表达显著增加，其复合物在缺血反应基因的增强区域与保守的低氧反应元件(5′-RCGTG-3′)相结合，将导致细胞转移，代谢转导和血管生成靶基因的表达变化等多种效应，特别是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。HIF-α在正常氧含量细胞中迅速被氧敏感的PHD(3种)降解，异源二聚化水平减少。

1.3HIF-1α和HIF-2α氧依赖调节机制 HIF-1α亚基依赖于在细胞内的有氧状态下通过HIF-α的氧依赖转录修饰。HIF-1α亚基在分子中间部分有两个独立的亚区域，被命名为氧依赖降解区(ODD),分别为N端-ODD和C端-ODD，这两个区域重叠两个激活区(NAD和CAD),在含氧量正常时表现去稳定性[6]。在氧含量正常的状态下，铁依赖性脯氨酸酰化酶羟化位于N端-ODD,C端-ODD中的两个关键的脯氨酸残基(HIF-1α的pro403，pro564和HIF-2α的pro531，pro405)。显性的PHDs定位于HIF脯氨酰羟化酶基因，即Egl-9。另外，HIF-1α亚基的天冬酰胺基位(HIF-1α的Asn803和HIF-2α的Asn855)在氧含量正常条件下还受HIF-1抑制因子酶羟化。因此，HIF的调节依赖两种氧依赖型调节机制。在低氧情况下，INF-α蛋白酶水解抑制，Asn羟化基被释放出CAD域允许转录单元活化。

1.4FH基因突变细胞或HLRCC肿瘤细胞株中“假缺氧”驱动机制 HLRCC的发病机制可能存在抗凋亡，氧化应激及“假缺氧”驱动机制，而“假缺氧”驱动发挥着重要作用，其在正常氧分压下细胞缺氧反应异常激活，而此途径存在不依赖低氧环境的HIF-1α的稳定表达。在氧分压正常条件下，HIF-1α的脯氨酸羟化作用允许VHL的识别及其介导的HIF-α降解。FH功能丧失时三羧酸循环受阻，延胡索酸积聚，糖酵解加强，激活PHD酶(铁依赖性脯氨酸酰化酶)抑制剂的活性，而抑制Von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白(Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein，pVHL)介导的HIF-α降解，HIF-α上调(HIF-β上调程度较轻)，HIF-α仅与HIF-β异二聚体化，引起级联效应，微血管密度增加，细胞内环境改变，从而有利于肿瘤发生。Yang等[7]利用UOK262细胞株证实氧化磷酸化受阻和加速糖酵解，是HLRCC三羧酸循环酶缺乏发生的必要环节。FH基因剔除小鼠的研究为在HLRCC肿瘤细胞株不依赖低氧环境HIF的稳定表达提供了有力支持，在其进展性肾囊肿中是以 HIF-1α表达升高和HIF激活下游Glut1(葡萄糖载体1)及VEGF基因转录增加为特点[8-9]。Sudarshan等[10]在FH失活的HLRCC细胞株UOK262检测到部分由NADPH氧化酶和蛋白激酶8介导的葡萄糖依赖的活性氧类增加，继而由活性氧类介导的HIF-1α稳定性增加，该研究解释了HLRCC肿瘤细胞高表达HIF-1α及激活缺氧途径基因的重要性。

1.5HIF-α可能在所有类型肾癌中稳定表达 VHL是遗传性肾癌最常见的类型，其主要机制是VHL基因突变，HIF-1α也在VHL突变的肾癌细胞中稳定表达。pVHL是哺乳动物E3泛素化连接酶复合物的底物识别组件，识别羟基化的HIF-α保守的脯氨酰残基由PHD催化发生羟基化，pVHL与elongin C、elongin B、Cul2、Rbx-1等蛋白结合形成一个多蛋白复合物聚泛素化HIF-α，继而26S蛋白酶降解HIF-α。VHL基因突变致pVHL功能失调，HIF-α不能被降解，HIF-α聚集，激活下游参与短期或长期适应缺氧的基因转录，这些基因主要有葡萄糖转运体1、碳酸酐酶Ⅸ、VEGF、红细胞生成素、转化生长因子α，血小板衍生因子β等。更有趣的是，HIF的上调可能在所有类型的肾癌中起核心作用。结节硬化症的基因1/2任何一个功能丧失都会破坏这两个蛋白的复合体和释放哺乳动物西罗莫司靶蛋白抑制剂，促使HIF-α合成表达，导致透明细胞型肾癌的发生。Kim等[11]进一步在不同类型的家族性肾癌患者的肾皮质瘤中研究HIF表达，BHD(Birt-Hogg-Dubé)综合征患者的嫌色细胞与嫌色细胞/嗜酸瘤细胞型肾肿瘤均一致性增强HIF-2α表达，HIF-1α表达也增强；来自遗传性乳头状肾癌(MET原癌基因突变)的Ⅰ型乳头中显示大约一半有HIF-2α高表达，另有一半有HIF-1α表达。哺乳动物西罗莫司靶蛋白及相关蛋白也是目前研究的热点，且肾癌病理生理学的关键通道和磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通道激活后可影响HIF的翻译，在肾癌的发病机制中发挥基础性作用。另有对FH基因剔除的小鼠肾囊肿研究发现，与选择性FH/HIF-1α和FH/HIF-2α基因剔除相比，FH基因缺失性肾囊肿与HIF-1α活性相关，甚至与PHD酶失活也相关[12]。

1.6HIF通过活性转录靶基因促进肾癌血管生成 肿瘤促进自身血管生成的能力是肿瘤的重要特征，在肾癌含氧量正常的条件下HIF活化是肿瘤血管生成的关键因素；在HLRCC肿瘤生长过程中出现“假低氧”驱动指令(活性氧类介导的HIF-α表达)而进一步促进内皮细胞募集和血管化。低氧反应异常活化，如VHL突变和HIF因子转录激活是肾癌中VEGF转录调控的主要机制。在VEGF的转录调控中对HIF-1α和HIF-2α的活进行比较分析，HIF-1α主要作用在VEGF受低氧刺激后上调，而HIF-2α在肾脏肿瘤(VHL或FH突变)的VEGF激活，另外还转录激活细胞周期蛋白D1、转化生长因子α[13]。促血管生成的很多分子的靶基因都由HIF活化，如血管生成素1、血管生成素4、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子等，它们与VEGF协同促进血管生成，尤其是血管生成素和VEGF协同，主要表现为抗细胞凋亡和促进血管稳定[14]。

1.7Nrf2-FH基因失活研究新热点 近年来，Nrf2活性在FH基因失活后影响的研究将逐渐成为热点，FH失活必将导致大量延胡索酸集聚，而延胡索酸作为硫醇反应复合物可在生理条件下与半胱氨酸残基的部分硫醇反应生成2-琥珀酸-半胱氨酸(2-succinyl-cysteine)[15]。目前将这种反应命名为琥珀酸化(succination)，区别于蛋白琥珀酰化(ssuccinylation)。琥珀酸化可调节大量含半胱氨酸残基蛋白的活性，其中包含Keap1(Kelch-like ECH2 assiciated protein 1，Keap1)[16-18]。在正常生理状态下，Keap1的双甘氨酸序列与细胞质中的Nrf2结合，使其成为E3泛素连接酶的底物，促进Nrf2泛素化被26S蛋白酶降解，故Nrf2维持在低水平。在氧化应激源作用的条件下，Nrf2与Keap1解耦联，进入细胞核与基因中的Maf蛋白合成异二聚体，继而识别并结合在抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)的GCTGAGTCA序列上，启动受ARE调控的基因转录。Nrf2-ARE信号转导通路可调节许多解毒酶的表达，研究发现，此信号转导路径破坏与大量肿瘤发生有关，如肺癌、前列腺癌等[19-20]。

目前研究表明，Keap1可能是一个新的抑癌基因，Keap1的C237和C288两个半胱氨酸残基对Nrf2-Keap1复合物发挥重要稳定性作用[21]，氧化Keap1 IVR(Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1)中的半胱氨酸硫醇即可导致其构象改变。FH基因失活的组织中存在Nrf2转录因子的过度表达，并证实FH基因失活细胞中Keap被琥珀酸化后引起Nrf-2的积聚和激活[12,22]。在基因表达分析的研究中，FH基因失活对Nrf-2活性发挥重要作用，FH基因失活组织中基因表达信号与Keap1基因剔除组织明显重叠，且Nrf-2靶基因也出现过表达[22]。在FH突变在组织中血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)的表达及其酶活性增加，HO-1过度表达可促使肿瘤细胞增殖、抗氧化应激、血管生成及病灶转移。HO-1特异性抑制剂(如锌原卟啉)可导致细胞凋亡增加，在对HLRCC的研究中发现，HO-1基因可能是FH基因失活的治疗靶点[23]。在一个替代模型的研究中发现，与Nrf2相关的HO-1表达调节被证实需完整的转换/蔗糖不可发酵(SWItch/sucrose nonfermentable,SWI/SNF)复合体，多种环节的变异(SWI/SNF相关、核质附着、肌动蛋白依赖调节染色质、SMARCA4)均可导致Nrf2和HO-1的表达解耦联[24]。有报道称，SWI/SNF复合体成分在肾癌突变的体细胞中普遍存在[25]。Shibata等[19]也发现在人类癌细胞中编码Nrf-2的DLG序列发生体细胞突变，这些氨基酸序列突变导致Nrf-2在核内累积并促进了Nrf-ARE调控基因的转录。目前尚没有直接的证据显示NRF激活是FH基因失活主要导致肿瘤的途径，但是在人类癌细胞中的Nrf2的表达是显著增加的，包括肺癌、乳腺癌及直肠癌等。除此之外，肾脏胚胎干细胞中的Nrf2活性被证实可诱导转录，并为Nrf2的致瘤活性提供了有力证据。另有大量研究发现，Nrf2可调节肿瘤组织中抗氧化酶的表达，导致肿瘤的耐药及生长活性增加[26]。Shibata等[19]还通过特异的小干扰RNA降低Nrf2表达水平逆转肿瘤耐药；与对照组相比，顺铂对转染了Nrf2小干扰RNA的EBC-1(由过氧化物处理Nrf2突变的癌细胞)和A549细胞(Keap1突变癌细胞)的抗肿瘤增殖作用更明显。Nrf2也参与FH基因失活肾囊肿中抗氧化反应途径，且其表达上调独立于HIF-PHD酶活性通路[12]。

2 HLRCC的治疗及预后

HLRCC发病早，临床上女性患者子宫平滑肌肌瘤多在30岁前甚至更早发病，病情也较重；皮肤平滑肌瘤发病年龄也较小；遇见此类情况，应该根据患者的临床表现反复询问其家族史、吸烟史、月经初潮及治疗等，条件允许可通过基因工程相关技术对血液、皮肤、子宫肿瘤瘤体的FH基因进行检测。大多数专家建议此类患者需要筛查和尽早干预，多推荐从15岁开始，每年进行腹部/盆腔CT或磁共振成像检查一次。HLRCC的肾癌发病较早，具有侵袭性，确诊后无论大小都建议行肾癌根治术。调节脯氨酰羟化酶活性抑制HIF(如R59949)的治疗正在研究中。对于肾透明细胞癌，HIF-1α表达增高作为不良的预后因素，是一个独立的生存率良好的预测指标[27]。肿瘤高表达HIF-1α的患者的生存率(平均13个月)显著低于低表达患者(平均24个月，P=0.005)。目前Nrf-ARE信号转导通路已成为抗肿瘤药物耐药的新靶点，对Nrf2抑制即可有增敏癌细胞的能力也可改善抗癌药物的敏感性。

3 结 语

HLRCC约占虽有肾脏恶性肿瘤3%，揭示和阐明这类综合征的基因基础，把握其生物学特征，不仅对治疗遗传性肾癌有重要意义，还可更好地认识散发性肾癌的生物学基础。由于HLRCC综合征多以皮肤及子宫平滑肌瘤较早发病，而其肾癌具有明显侵袭性，加强其生物学以及FH基因遗传学发病机制的认识，提早干预，筛查及相关治疗措施。

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