一株H5N2亚型流感病毒的全基因组序列分析及致病性的研究

李文辉，关立峥，张 芳，王 晶，卢昆鹏，施建忠，邓国华，陈化兰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)

流感病毒(Influenza virus)属于正粘病毒科流感病毒属，基因组由8 个单股负链RNA 节段组成，根据流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的差异，A 型流感病毒分为16 种HA 亚型和9 种NA 亚型[1]。根据致病性高低可以分为高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。H5N2亚型流感病毒高低两种致病性均存在，主要存在于迁徙的鸟类，最近也从家禽和哺乳动物体内分离得到。相关研究显示，在家禽市场中，H5N2 出现持续的重组变异[2]。2012 年在西藏的鸡群中就分离到一株天然的H9N2 和H5N1 重组的H5N2 亚型流感病毒[3]。近期报道表明，对水禽长期使用某种药物会导致H5N2 亚型流感病毒发生突变进而更易于感染人类[4]。因此本研究对2012 年我国湖南省环境中分离到的一株H5N2 亚型流感病毒进行了全基因组进化分析及对家禽和小鼠的感染性的研究，初步评价该类H5N2 亚型流感病毒对家禽及哺乳动物的感染情况，为H5N2 亚型生物学特性的研究提供数据支持，进而对H5N2 亚型流感病毒的监测和防控发出预警。

1 材料和方法

1.1 病毒株和实验动物 H5N2 病毒分离株来自2012 年湖南省鸭群环境中的正常水样监测样品，由国家禽流感参考实验室分离保存，病毒命名为：EN/HuN/S3794/2012(H5N2)(EN/HuN/794/12)。10 日龄～11 日龄SPF 鸡胚及4 周龄SPF 鸡、SPF 鸭均购自本研究所实验动物中心；6 周龄雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2 主要试剂 RNA 提取试剂TRIzol LS 及反转录酶(MLV)试剂盒购自Invitrogen 公司；DNA 聚合酶、dNTPs 和DNA Marker DL2000 均购自TaKaRa 公司；胶回收试剂盒购自OMEGA 公司；BigDye Terminator测序试剂盒3.1 version 购自ABI 公司；BigDye Seqque-ncing clean Up kit 购自MCLAB 公司。

1.3 病毒增殖及鸡胚半数感染量(EID50)测定 将流感病毒分离株经有限稀释后利用10 日龄～11 日龄SPF 鸡胚纯化3 代，进行病毒增殖后保存。将其按10 倍倍比稀释，各稀释度经尿囊腔接种4 枚10 日龄～11 日龄SPF 鸡胚，37 ℃培养，48 h 后收集尿囊液测其血凝价，根据Reed-Muench 法计算EID50。

1.4 全基因组序列分析

1.4.1 核酸的提取及RT-PCR 扩增 参照文献[5]的方法提取病毒RNA，根据GenBank 中H5 亚型流感病毒各基因片段序列选择同源性最高的区域设计PCR 引物进行目的片段的扩增，以琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，并利用胶回收试剂盒进行纯化。

1.4.2 序列测定及分析 采用BigDye Terminator 试剂进行测序产物纯化，于ABI 测序仪中测序；利用DNAStar 软件中SeqMan 程序进行序列拼接，利用MegAlign 进行同源性比较；应用Mega5 进行进化树的绘制及进化分析。

1.5 抗原性差异分析 将该株流感病毒制成标准的四单位血凝抗原，按照WHO 颁布的标准的HA-HI 实验方法进行交叉HA-HI 试验的检测[6]，测定病毒对异源病毒血清的交叉血凝抑制效价。具体病毒株名称见表1。

表1 抗原性分析选用的病毒株Table 1 Isolate antigenic analysis with reference strains

1.6 动物感染性试验

1.6.1 对SPF 鸡和SPF 鸭的感染性试验 以106EID50/100 μL 病毒鼻腔感染4 周龄SPF 鸡和SPF 鸭各11只，以接种PBS 作为对照，于负压隔离器中饲养。感染72 h 后各迫杀3 只，并采集脑、气管、胸腺和肝脏等11 种组织脏器。剩余实验动物感染后连续10 d 采集咽喉拭子和泄殖腔拭子，接种11 日龄鸡胚进行组织脏器和拭子病毒含量的滴定；感染后14 d采血，检测血清转阳情况。

1.6.2 对BALB/c 小鼠的感染性试验 将病毒稀释到终浓度为106EID50/50 μL，鼻腔感染50 μL，感染组8 只，对照组5 只接种PBS；72 h 后迫杀3 只，采集脑、脾、肾、肺和鼻甲骨5 种脏器匀浆后8 000 r/min，离心3 min 后收集上清液，接种11 日龄鸡胚进行组织病毒含量的滴定。剩余小鼠连续观察14 d，每天记录小鼠体重变化及死亡情况。

2 结果

2.1 全基因组序列分析

2.1.1 核苷酸序列分析 将测序后的全基因组序列经DNAStar 软件中的SeqMan 软件拼接校正，通过Blast 比对显示：各基因片段与2011 年本实验室分离到的一株DK/HuN/S4120/2011(H5N2)(DK/HuN/120/11)高度同源(表2)。EN/HuN/794/12 与DK/HuN/120/11 的8 个基因片段同源性均很高，在97.4 %～99.3 %之间。

序列分析显示，在HA 序列中不存在多个连续碱性氨基酸，不具有HPAIV 的典型结构特征。HA蛋白的潜在糖基化位点分别为26NNS28、27NST29、39NVT41、181NNT183、302NNS304、500NGT502和559NGS561。以H3 亚型HA 为模板比较影响流感病毒HA 受体结合位点氨基酸序列表明，影响HA 受体结合特异性的位点有121S、133S、134A、139G、186E、188T、189K、193N、210I、218K、222Q、223S、224G、251E、315T、388K 和497R。这些位点中，除了210I 为人型受体氨基酸外，其余位置均未发生变异。NA 无颈部缺失，NA 的潜在糖基化位点分别为45NHT47、63NWS65、123NGT125、177NAT179、379NWS381；内部基因中，NS 基因的80～84位未出现大部分H5N1 流感病毒出现的缺失现象，PB1 和PB2 基因分别发生N375S 和T339K 的点突变。

表2 EN/HuN/794/12 株与DK/HuN/120/11 株的全基因组核苷酸同源性比较Table 2 Homology of whole genomics between EN/HuN/794/12 and DK/HuN/120/11 viruses

2.1.2 遗传进化分析 将EN/HuN/794/12 的8 基因节段分别同H5 亚型流感病毒各分支的参考序列进行比较，并构建各基因片段的系统进化树(图1)。结果显示，HA 的进化树中，EN/HuN/794/12 与DK/HuN/120/11、WB/Korea/L60-2/08 和EWC/Vietnam/8/07 在同一个分支上，为同一祖先进化而来，与H5N1 亚型分支、H5N2 欧亚系分支及H5N2 北美分支均差距较远，同源性与Korea/L60-2 分支为76.7%～82.9 %；其同源性最高的DK/HuN/120/11 病毒株与亚洲其它地区出现的H5N2 进化关系较远，文献报道称DK/HuN/120/11 可以作为湖南省洞庭湖地区H5N2 亚型流感病毒来源的祖先[7]。

NA 的进化树中，EN/HuN/794/12 与WB/Korea/L60-2/08 和EWC/Vietnam/8/07 位于同一小分支上，并且同源性大于95 %，它们与DK/HuN/120/11 来源于同一祖先，而与其它HA N2 亚型流感病毒亲缘关系均很远。

内部基因中，除M 基因没有与DK/HuN/120/11在一个小分支上，但同源性也高于95 %，其余的片段均与DK/HuN/120/11 高度同源，所有的内部基因片段与各分支H5N1 亚型AIV 及欧亚和北美系的H5N2 亚型AIV 的内部基因片段进化关系均较远，表明内部基因来源单一，不存在重组变异。

图1 EN/HuN/794/12 株的基因进化树Fig.1 Phylogenetic tree of EN/HuN/794/12

2.2 抗原性差异分析 通过进行HA-HI 试验，利用本实验室保存的H5 亚型AIV 参考病毒株的标准抗原和对应的阳性血清以及本研究的分离株进行抗原性分析。结果显示，EN/HuN/S3794/2012(H5N2)与目前使用的Clade2.3.4 疫苗株、Clade7 疫苗株和(Clade2.3.2.C)Re-6 疫苗株之间抗原差异较大(表3)。

2.3 对SPF鸡和SPF鸭的感染性试验 以106EID50/100 μL 剂量病毒感染SPF 鸡和SPF 鸭后，均无明显临床症状，病毒滴定显示咽喉拭子、泄殖腔及脏器中均未检测到病毒，表明病毒感染SPF 鸡和SPF 鸭后不能通过呼吸道和消化道排毒，在鸡和鸭体内不能有效复制；感染后14 d 血清检测结果为阴性。结果表明该病毒对SPF 鸡和SPF 鸭的感染性较弱，不具备在鸡群和鸭群间发生有效传播的能力。

2.4 对BALB/c小鼠的感染性试验 以106EID50/50 μL 病毒鼻腔感染BALB/c 小鼠后小鼠无明显的临床症状，14 d 内体重也未发生明显变化。脏器滴定结果显示，该病毒只能在肺脏内复制，不能引起全身复制(图2)，结果表明该病毒对小鼠的感染性较弱。

表3 抗原性差异分析结果Table 3 Antigenic differences analysis by HA-HI tests

图2 感染3 d 后小鼠脏器滴定结果Fig.2 Virus titration in mice organs on day 3 post inoculation

3 讨论

H5N2 亚型流感病毒在野鸟中通常呈低致病性，但在其感染家禽后，可能变异为HPAIV[8-9]。LPAIV有可能为HPAIV 提供某些基因片段，间接导致AIV的暴发[10]。本研究EN/HuN/794/12 与DK/HuN/120/11、WB/Korea/L60-2/08 和EWC/Vietnam/8/07 具有共同祖先，而这些病毒与亚洲流行的其他H5 亚型流感病毒进化关系很远。其对SPF 鸡和SPF 鸭感染能力均很低，对小鼠也为低滴度感染，但也应该加强重视，防止病毒适应宿主。EN/HuN/794/12 株与DK/HuN/120/11 同样来自湖南省洞庭湖区域，此区域是候鸟迁徙的重要栖息地，病毒在鸟类体内经过长期进化可能发生基因突变，也可能通过候鸟的迁徙导致该类型病毒发生基因重组和替换，产生新亚型流感病毒；另外具有同一来源的WB/Korea/L60-2/08 和EWC/Vietnam/8/07 都是从亚洲的野鸟体内分离得到，表明在亚洲可能存在通过野鸟迁徙路径携带该病毒。该病毒对家禽感染性较弱，但能够存在于家禽体内，其种类繁多，数量巨大，监察监管较为困难，一旦暴发疫情很难控制，所以存在着潜在的危害性。总之，本研究为LPAIV 特别是H5N2 亚型流感病毒的科研工作提供数据支持，加强有关方面对该类病毒的重视程度，为该类病毒的流行病学监测采用可行性方案提供实验依据，为可能对家禽及人类造成的危害发出早期预警。

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