一株不能被高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)疫苗抗血清中和的HP-PRRSV的分离鉴定

陈家锃，白 云，常 丹，张秋月，王 倩，冷超粮，张武超，赵鸿远，叶 超，李 琳，田志军*，彭金美，安同庆，童光志

(1.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；3.中国农业科学院 上海兽医研究所，上海 200241)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRSV 引起的，能够导致妊娠母猪繁殖障碍和各种年龄阶段猪呼吸症状的猪病毒性传染病，该病呈世界性流行，为严重威胁养猪业的重要传染病之一。

国内于1996 年首次分离到PRRSV 即CH-1a 株[1]，2006 年下半年一种以高热(超过41 ℃)、高发病率(超过50 %)和高死亡率(高于20 %)为主要特征的“无名高热症”在我国江西省猪群中暴发，并迅速蔓延至全国28 个省、市和自治区，造成了巨大的经济损失[2-4]。经鉴定该病的病原为PRRSV 变异株HP-PRRSV[5-6]。2010 年以来，随着HP-PRRSV 致弱活疫苗的使用，HP-PRRS 在我国得到了有效的控制。但PRRSV 具有病毒变异较快的特点，因此对病毒的持续监测具有重要意义。本研究从某疑似PRRS 发病猪场的病料中分离了一株HP-PRRSV，其中和抗原发生了较大变异，不能被HP-PRRSV 抗血清中和，属于一株HP-PRRSV 新变异病毒株。该病毒株的分离鉴定对于PRRSV 流行病学研究具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 病毒株及病料的来源 HP-PRRSV 疫苗株HuN4-F112 由本实验室保存；病料采集于河南某发病猪场死亡仔猪的肺脏。自2012 年下半年起，该猪场出现妊娠母猪流产，新生仔猪厌食消瘦、呼吸道症状，体温升高至41 ℃并持续3 d～4 d，死亡的仔猪剖检后发现淋巴结出血，肺部实变等典型的PRRS 症状。

1.2 主要试剂及材料 Marc-145 细胞、大肠杆菌TG1 株及抗PRRSV 的M 单克隆抗体(MAb)由本实验室保存；猪肺泡巨噬细胞(PAM)采用肺灌洗技术收集；pMD18-T、LA Taq、AMV 等均购自TaKaRa公司；RNeasy Plus Mini RNA 提取试剂盒购自于Qiagen 公司；FITC 标记的山羊抗鼠IgG(IgG-FITC)购自北京中杉金桥公司；免疫HP-PRRSV 活疫苗(HuN4-F112 株)仔猪制备的具有中和活性的血清由本实验室制备[7]。

1.3 病毒的分离 取0.1 g 病料经研磨后稀释于1 mL RPMI-1640 培养液中，离心后取上清液用0.22 μm的滤器过滤，将滤液接种于贴壁培养的PAM 细胞单层中，于37 ℃5 % CO2中培养48 h，取100 μL上清液接种下一代PAM 细胞，盲传3 次。

1.4 间接免疫荧光(IFA)鉴定 取部分接种病毒的PAM 细胞，用冰浴的丙酮固定于8 孔载玻片上，以抗PRRSV M 蛋白MAb 为一抗，羊抗鼠IgG-FITC为二抗进行IFA 鉴定。

1.5 病毒核酸检测 按照AMV 酶的操作说明书步骤将提取的接种病毒后的PAM 的RNA 反转录为cDNA，分别以PRRSV NSP2 区和GP5 区的特异性的引物进行PCR 鉴定[2]。

1.6 全序列测定 以HP-PRRSV HuN4 株的基因组为参考序列设计合成了9 对引物(相关引物信息如果读者需要作者可以提供)，利用这些引物对分离到的病毒株进行基因PCR 扩增,并将这些基因片段克隆到pMD18-T 载体中测序，最后对其全基因组序列进行拼接。

1.7 血清中和试验鉴定 按照Read-Muench 的方法在Marc-145 细胞上对分离的病毒株的毒价进行测定。采用终点法中和试验，固定病毒稀释血清法检测HP-PRRSV 阳性抗血清对分离病毒株中和效价[8]，并以疫苗株HuN4-F112 作为阳性对照。

2 结果

2.1 病毒分离鉴定结果 将处理的病料接种于PAM 细胞中传代4 次后，采用PRRSV M MAb 进行IFA 检测显示，传代的PAM 细胞中出现特异的荧光(图1)；此外，利用针对病毒GP5 和NSP2 区的引物进行RT-PCR 检测，结果表明，扩增产物约为7 50 bp(图2)。表明分离到的病毒株为PRRSV，命名为HEL-12 株。

图1 间接免疫荧光鉴定结果Fig.1 Identification of the virus isolate with MAb against PRRSV M protein by IFA

2.2 全序列分析 对分离株HEL-12 全基因组序列分9 段扩增(图3)，分别测序并拼接，其全长为15 338 bp。该序列已提交到NCBI(序列号：KJ019330)。通过DNA star 软件分析显示，与经典病毒株CH-1a、VR2332、PA8 和JA142 相比HEL-12的NSP2 区存在HP-PRRSV(1+29)位氨基酸的缺失的典型特征，进化树分析表明HEL-12 与HP-PRRSV JXA1、HuN4 等均位于共同的分支，属于HP-PRRSV。但相比较而言HEL-12 位于基因进化树最末端，与HP-PRRSV JXA1 和HuN4 的基因距离均较远，表明其可能发生了较大的变异(图4)。

图2 RT-PCR 鉴定结果Fig.2 Identification of the virus isolateby RT-PCR

图3 基因组分9 段扩增结果Fig.3 The amplification of the 9 overlapping fragments of the PRRSV genome

图4 HEL-12 与18 株美洲型PRRSV 全基因序列进化树分析Fig.4 Phylogenetic analysis of the whole genome among North American PRRSV

序列比对显示，GP5 与HP-PRRSV 的代表株JXA1、HuN4 和TJ 相比共有11 个氨基酸位点的突变(表1)，同源性为96.7 %，其氨基酸突变位点集中位于aa26～aa35 区域(6 个点突变)，该区域位于GP5 蛋白的信号肽(aa1～aa31)附近，其他突变位点位于58、61、103、196 和200 位氨基酸。对其10个阅读框(ORFs)与HP-PRRSV 代表株JXA1、HuN4及TJ 相应的ORF 进行比对显示，其ORF1b、ORF6及ORF7 编码的蛋白M 和N 变异相对较小，同源率分别为98 %、99.0 %和98.9 %，变异最大的阅读框为ORF1a 和ORF2-5 同源率为95.7 %～97.3 %，表明其表面抗原发生了较大变异。通过软件DNAStar与17 株美洲型PRRSV 的比对结果显示，HEL-12 与经典株如CH-1a 和VR2332 株同源性偏低，同源率为87.6%～94.3%，与2006 年以后分离的HP-PRRSV同源性相对较高，为97 %左右，但其他10 株HP-PPRSV 彼此间的同源率均在99 %以上，HEL-12与HP-PRRSV 同源率显然是偏低的，表明其变异很大。

表1 PRRSV HEL-12 的GP5 蛋白氨基酸突变Table 1 Amino acid mutation in GP5 protein of HP-PRRSV

2.3 病毒中和试验结果 采用10 份对HuN4-F112中和效价为40 倍以上的血清对分离株进行病毒中和试验，结果显示，10 份血清最小稀释10 倍时仍不能中和分离株HEL-12(表2)，表明其抗原尤其是中和抗原发生了较大的变异。

表2 10 份血清针对不同毒株的交叉中和效价Table 2 Virus neutralization titers of 10 ant-sera against the PRRSVs

3 讨论

PRRSV 疫苗株如CH-1R、MLV 和F112 均由Marc-145 细胞中传代致弱的，与野毒株相比，疫苗株更易在Marc-145 细胞中培养，因此当采用Marc-145 细胞从PRRSV 活疫苗免疫猪的病料中分离野毒株时，可能会受到疫苗病毒株的干扰。本研究室研究结果表明疫苗病毒株在PAM 中复制能力很弱，接种PAM 后传代2 次后，采用RT-PCR 方法即检测不到病毒核酸(结果未显示)。本研究采用PAM 快速分离一株PRRSV 野毒，NSP2 基因序列分析表明该分离株属于HP-PRRSV，但与参考序列相比其基因组出现了较大变异，主要变异区域位于结构蛋白GP2～GP5 及非结构蛋白NSP2 区。血清中和试验结果显示HP-PRRSV 疫苗株制备的血清不能中和该分离株，表明其中和抗原发生了较大变异。有报道表明不同PRRSV 株间结构蛋白GP5 和非结构蛋白NSP2 的差异导致其较差的抗体交叉中和活性[9-10]，因此分离株HEL-12 结构蛋白GP2～GP5及非结构蛋白NSP2 区的变异可能是导致该分离株不能被HP-PRRSV 抗血清中和的原因。

总之，本研究在对PRRSV 监测中，分离到一株有意义的HP-PRRSV 新变异株，其基因组又出现了新的变异，特别是中和抗原区发生了较大变异，因此监测其流行性对PRRSV 流行病学的研究具有现实意义。

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