鳜鱼传染性脾肾坏死病毒Taq Man 荧光定量PCR 检测方法的建立
2014-03-08张崇文张明辉何正侃
安 伟,肖 雨,张崇文,张明辉,何正侃
(上海市水产研究所 上海市水生动物疫病预防控制中心,上海 200433)
2001 年我国首次从鳜鱼中分离到传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)[1],并先后完成了病原病理研究[2]及病毒全基因组的测序工作[3],该病毒属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属,其感染水生动物导致高发病率和高死亡率,给鳜鱼养殖业带来了严重的经济损失。因此,亟待建立一种快速、灵敏、特异的检测方法对病原进行及时诊断。
荧光定量PCR(qPCR)检测方法特异性强、灵敏度高、能够定量并且有效解决PCR 污染问题,已在医学领域、微生物和动植物疾病检疫方面广泛应用[4-6]。目前,尚未有应用qPCR 技术对ISKNV 进行检测的研究报道,本实验建立的检测ISKNV Taq-Man qPCR 方法,能够对ISKNV 进行定性和定量检测,对鳜鱼病原的诊断和防控具有重要意义。
1 材料和方法
1.1 病 毒 ISKNV 由农业部渔业动植物病原库提供;流行性造血器官坏死病毒(EHNV)由连云港出入境检疫局动植物实验室提供;鲤春病毒血症病毒(SVC)由深圳出入境检疫局动植物实验室提供;草鱼呼肠孤病毒(GCRV)由中国检验检疫科学研究院动检所提供。
1.2 主要试剂 Ex Taq DNA 聚合酶、PCR 反应液、pMD18-T 载体,探针法荧光定量试剂盒以及DNA提取试剂盒等均购自TaKaRa 公司;胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Axygen 公司。
1.3 引物及探针的设计与合成 根据GenBank 中ISKNV 基因组中 MCP 蛋白编码基因序列(AF371960),应用Primer 5 软件设计一对引物和一条探针。序列为:F:5'-ATGCCAATCATCTTGTTG TAGCC-3';R:5'-GGTGTCATTTAACGACCTGGT G-3';Probe:5'-FAM-AGACCCTGACCACGAGTTCC TTGACTT-TAMARA-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,预期扩增的目的片段为142 bp。
1.4 重组质粒标准品的制备 按照DNA 基因组提取试剂盒说明提取的ISKNV 基因组为模板,应用特异性引物扩增MCP 基因部分片段。反应条件:94 ℃5 min;94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s,共35 个循环;72 ℃10 min。产物经2 %琼脂糖电泳检测。回收目的片段克隆于pMD18-T 载体中,构建重组质粒pMD-MCP,并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。
1.5 qPCR标准曲线的建立 对qPCR 反应体系、反应条件进行优化,参照试剂盒中20 μL 体系反应要求,筛选引物浓度以及退火温度等条件,以获得最低的Ct 值和较高的荧光强度增加值,提高实验结果的精准性。
根据测定重组质粒pMD-MCP 的OD260nm值,换算成质粒浓度,用双蒸水10 倍倍比稀释(1.95×108拷贝/μL~1.95×103拷贝/μL),以其为模板,根据优化的最佳反应条件进行扩增,利用分析软件绘制标准曲线。
1.6 灵敏性试验 将重组质粒pMD-MCP 标准品10倍倍比稀释后(1.95×108拷贝/μL~1.95×10 拷贝/μL)进行qPCR 和普通PCR 反应,每个梯度浓度设3 个重复,以确定这2 种方法的检测下限,比较两种方法的灵敏性。
1.7 特异性试验 提取ISKNV、SVC、EHNV 和GCRV 的cDNA 或DNA 为模板,以建立的qPCR 方法进行特异性检测,同时设无模板对照。
1.8 重复性试验 将重组质粒pMD-MCP 标准品稀释3 个浓度梯度(1.95×103拷贝/μL,9.75×105拷贝/μL,1.95×106拷贝/μL,每个梯度设5 个重复,分成3 个批次(A,B,C),进行批内和批间的重复性试验。
1.9 临床样品检测 采用建立的qPCR 方法,对2012 年上海地区收集的5 份不同养殖单位疑似患病鳜鱼进行ISKNV 检测,每份样品2 个重复,初步验证其应用效果。
2 结果
2.1 重组质粒标准品的制备 经ISKNV 组织提取病毒DNA,进行PCR 扩增MCP 基因部分片段,得到约150 bp 产物(图1)。将目的基因克隆到质粒pMD18-T 中构建的重组质粒经测序与预期目的片段完全一致,命名为pMD-MCP。将其作为重组质粒标准品,提取的pMD-MCP 检测浓度为32.5 μg/mL。
2.2 qPCR标准曲线的建立 经优化qPCR 20 μL的反应体系:Premix Ex Taq(2×)为10 μL,上下游引物10 μmol/L 各0.4 μL,探针引物10 μmol/L 为0.3 μL,Rox 为0.4 μL,质粒模板1 μL,灭菌水7.5 μL。反应程序:95 ℃30 s、95 ℃5 s、62 ℃30 s,40 个循环;62 ℃进行荧光检测,每个梯度浓度设3 个重复。以10 倍倍比稀释的pMD-MCP 为模板进行qPCR,得到相应的标准曲线和动力学曲线(图2)。依据质粒拷贝数与Ct 值的线性关系,由7500 Software v2.0 软件得到标准曲线。其中横坐标代表质粒模板拷贝数,纵坐标为Ct 值,曲线方程为y=-3.213x+42.884。R=0.994,E=104.742%。
图1 重组质粒的鉴定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid
图2 qPCR 的标准曲线和动力学曲线图Fig.2 Standerd and dynamic curves of qPCR
2.3 敏感性试验结果 通过对重组质粒pMD-MCP各稀释度样品进行qPCR 和普通PCR 检测。结果显示,该方法检测下限为20 拷贝/μL,Ct 值为34.99±0.15,而普通PCR 法的检测下限为1.95×104拷贝/μL(图3)。
图3 qPCR(A)与普通PCR(B)敏感性试验Fig.3 Sensitivity tests of qPCR(A)and traditional PCR(B)
2.4 特异性试验结果 采用建立的qPCR 方法对ISKNV、SVCV、EHNV、GCRV 进行检测,结果表明仅ISHNV 病毒核酸有荧光信号,而其他病毒核酸均无荧光信号(图4)。
图4 ISKNV qPCR 特异性试验结果Fig.4 Specificity test of qPCR for ISKNV
2.5 重复性试验结果 根据重组质粒稀释不同的浓度和批次,进行数据和统计分析结果显示,批内和批间的变异系数均小于0.7 %(表1)。
2.6 临床病样的检测结果 将采集的5 份疑似病料样品分别利用建立的qPCR 和常规PCR 检测,结果显示,qPCR 能够检测5 份样品全部为阳性,而常规PCR 只能检测出其中的3 份样品为阳性。
表1 qPCR 检测ISKNV 批内及批间重复试验结果Table 1 Intra-and inter-batch reproducibility of qPCR assay for ISKNV
3 讨论
目前,解决ISKNV 感染传播的最有效办法是采取预防措施,即对病毒实行快速准确的检测预报。目前,应用常规PCR、套式PCR、qPCR 以及环介导的等温扩增等技术检测水生生物病毒已有相关报道[7-9]。其中,qPCR 技术优势明显,在重大疫情病原定量检测中广泛应用。
本研究通过设计并筛选出特异性的引物及探针,优化反应体系中引物、探针浓度及退火温度时间等反应条件,建立了ISKNV qPCR 的检测方法。其标准曲线线性关系良好,回归系数达到0.994,能够对病毒拷贝数精确定量检测,确定感染程度。灵敏度下限可达20 拷贝/μL,即可以检测到2.1×10-3pg/μL 的病毒核酸,比邓敏报道的常规PCR 方法灵敏度高出1 000 倍[10]。特异性强,与其他几种鱼类病毒病原无交叉反应,能够快速准确的进行定性分析。该方法的重复性好,批内和批间的变异系数均小于0.7 %,表明该检测体系稳定,适于大批量的病原样品检测。
采用建立的ISKNV qPCR 方法进行临床疑似病样的检测,结果与实际情况相符,并且敏感性高于普通PCR。该方法从病毒核酸提取到检测结果的完成只需1 h~2 h,显著提高了检测效率,适合在短时间内完成大量样品的病原学诊断及检疫。
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