酰基化蓝莓花青素的稳定性研究

赵立仪，李路宁，申芮萌，朱 宁，孙爱东，*

（1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京 100083；2.北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083）

酰基化蓝莓花青素的稳定性研究

赵立仪1，2，李路宁1，2，申芮萌1，2，朱 宁1，2，孙爱东1，2，*

（1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京 100083；2.北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083）

采用月桂酰氯作为酰化试剂与自提蓝莓花青素酰化，对酰化后产物的稳定性进行了分析，并对不同浓度添加剂、金属离子以及氧化还原剂对酰化后蓝莓花青素稳定性的影响进行了研究。结果表明：酰化后蓝莓花青素对光、热和强氧化剂稳定性显著提高；VC、苯甲酸钠、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸钠等可以提高酰化后蓝莓花青素的稳定性。K+、Na+、Cu2+以及浓度小于0.05mol/L的Fe2+对其无显著性影响；Ca2+/Fe3+以及浓度达到0.1mol/L的Mg2+、Fe2+对其具有破坏作用。

蓝莓花青素，酰基化，稳定性

蓝莓（Blueberry）又称越桔，杜鹃花科越桔属多年生落叶或常绿灌木，分布于亚寒带、温带及亚热带。蓝莓果实为浆果，果肉细腻，酸甜适度，既可以鲜食，也可以加工成果汁饮料、果酒饮品等。蓝莓除含常规的营养成分外，还含有丰富的花青素。经研究发现，花青素具有保护和改善视力，治疗心血管疾病，预防肥胖，防止脑神经老化，预防癌症等功能[1-2]。蓝莓花青素是水溶性色素，在光照、高温和氧气的作用下很容易被降解，成为阻碍其在食品工业中应用的瓶颈。为了改善花青素的稳定性，扩大此类色素的应用领域，人们分别采用加辅色剂、抗氧化剂、螯合剂、微胶囊以及化学修饰的方法来提高花青素的稳定性[3-5]。国内外大多采用乙酸等羧酸作为酰化剂，酰化效果不理想，反应进行较慢。本文采用月桂酰氯作为酰化剂，将蓝莓花青素酰化，较之前研究反应更为彻底迅速。并研究酰基化蓝莓花青素的稳定性，这对进一步开发利用蓝莓花青素具有重要意义[6-7]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生蓝莓样品 产于大兴安岭林区，-80℃冷冻保存；色谱纯甲醇 购于Fisher公司；月桂酰氯、甲醇、三氟乙酸、TFA、蒸馏水、蔗糖、葡萄糖、双氧水、硫酸亚铁、硫酸钠、氯化钾、柠檬酸、柠檬酸钠 国药集团化学试剂有限公司；以上化学试剂 除特殊说明外均为分析纯。

水浴锅 天津实验电炉有限公司；UV-1200紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；Senco旋转蒸发仪 上海申顺生物科技有限公司；FA1604N电子分析天平 上海精密仪器厂；JB-5型定时双向数显恒温磁力搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；FD-18真空冷冻干燥机 北京德天佑科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓花青素的提取 参考Fossen等[8]方法并加以改进。将在-80℃下贮藏的蓝莓鲜果在0℃下解冻24h，然后将其研磨成浆，按照料液比1∶5加入含0.5%三氟乙酸（TFA）的甲醇溶液，在0℃下封口、遮光搅拌提取24h。将提取液置于5000r/min的离心机中离心15min，收集上清液。取上清液于低于38℃的旋转蒸发仪中浓缩，除去甲醇，得到浓缩液。

1.2.2 蓝莓花青素的纯化 将浓缩液用1∶1（V∶V）乙酸乙酯萃洗，反复振荡，除去上层脂类物质，将此操作反复3次。将除去脂类的浓缩液通入离子交换树脂XAD-7柱，用含0.5%TFA的蒸馏水以20倍柱体积冲洗柱子，除去非花青素化合物。然后通入含0.5%TFA的甲醇洗脱柱子，收集洗脱液。将收集的洗脱液于38℃的旋转蒸发仪中真空浓缩除去甲醇，得到纯化的花青素溶液。

1.2.3 蓝莓花青素的酰化 参考李颖畅[9]的方法并加以改进，将提纯的蓝莓花青素溶液与月桂酰氯以1∶3的比例混合，在90℃下水浴加热40min，取出后冷却至室温，用紫外可见分光光度计在200~400nm处测定光谱，观察在290~330nm是否有吸收峰，如果有则说明发生了酰基化[10]。将冷却后的蓝莓花青素酰化溶液用pH=3的柠檬酸-柠檬酸钠溶液稀释50倍，用于稳定性的测量。

1.2.4 不同条件对酰化蓝莓花青素稳定性的影响

1.2.4.1 已酰化花青素保存率的测定方法[11-13]分别取稀释后样品1mL，加入pH为1.0、4.5的缓冲液9mL，40℃水浴平衡40min后，于304nm和548nm波长下测定吸光度，并按下式进行计算：

花青素含量（mg/L）=（A×MW）/（∑×1）×Df×1000保存率（%）=A2/A1×100

式中，MW为酰化后的矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量；∑-摩尔消光系数；Df-稀释因子（样品总的稀释倍数）；A2已处理的酰化花青素吸光值；A1未处理的酰化花青素吸光值。

pH1.0的缓冲液：准确称取1.49g KCl用蒸馏水定容至1009mL。准确量取1.7mL盐酸（分析纯）用蒸馏水定容至100mL，配成0.2mol/L盐酸溶液，将KCl溶液与盐酸溶液以25∶67的比例混合。用KCl溶液调pH（1.0±0.1）。

pH4.5的缓冲液：准确称取1.64g醋酸钠用蒸馏水定容至100mL，用盐酸调pH（4.5±0.1）。

1.2.4.2 酰化蓝莓花青素的热稳定性 将已稀释的酰化蓝莓花青素溶液分别取30mL 3份放入80、100、120℃的水浴锅中，每隔一定时间（2、4、6、8、10h）测定其含量变化。

1.2.4.3 酰化蓝莓花青素的光稳定性 取已稀释的酰化蓝莓花青素50mL装入白色试剂瓶中，在自然光照条件下贮存。每隔2d测定其含量变化。

1.2.4.4 添加剂对酰化蓝莓花青素的影响 取已稀释的酰化蓝莓花青素每份30mL分别加入不同浓度的VC、蔗糖、葡萄糖、苯甲酸钠、柠檬酸，对照组加30mL蒸馏水，室温静置2h，测定其含量变化。

1.2.4.5 金属离子对酰化蓝莓花青素的影响 取已稀释的酰化蓝莓花青素每份30mL，分别加入不同浓度的Na+、K+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+在2、4、6、8、10h测定其含量变化。

1.2.4.6 氧化还原剂对酰化蓝莓花青素的影响 取已稀释的酰化蓝莓花青素每份30mL，分别加入不同浓度的亚硫酸钠、过氧化氢溶液，静置30min，测定其含量变化。

2 结果与分析

2.1 酰化蓝莓花青素的紫外吸收光谱

测定酰化蓝莓花青素在200~400nm的吸收光谱，观察在290~330nm是否有明显吸收峰，如果有则说明发生了酰基化[10]。蓝莓花青素与月桂酰氯发生酰化反应后，在紫外光谱中304nm处出现吸收峰，如图1所示，说明蓝莓花青素已经酰化。

图1 酰基化蓝莓花青素紫外-可见吸收光谱图Fig.1 The ultraviolet-visible absorption spectrum of acylated blueberry anthocyanins

图2 加热80℃对酰化花青素和未酰化花青素的影响比较Fig.2 Effect comparison of 80℃ between the acylated anthocyanins and proanidine

2.2 温度对蓝莓中已酰化花青素的影响

由图2~图4可以看出，随着温度的升高和加热时间的延长，酰化的蓝莓花青素和未酰化的蓝莓花青素的保留率都下降。但从图中可以看出，在80、100、120℃加热0~2h，酰化花青素和未酰化花青素的保留率没有显著性差距，但当加热时间大于4h后未被酰化的蓝莓花青素下降速率明显高于酰化的蓝莓花青素，说明蓝莓花青素酰化后耐热性提高。在80、100、120℃加热10h后酰化的蓝莓花青素保留率分别为83.24%、74.17%和62.17%，明显高于未被酰化的蓝莓花青素，说明蓝莓花青素酰化后热的稳定性显著（p＜0.05）提高。

2.3 光照对蓝莓中已酰化花青素的影响

图3 加热100℃对酰化花青素和未酰化花青素的影响比较Fig.3 Effect comparison of 100℃ between the acylated anthocyanins and proanidine

图4 加热120℃对酰化花青素和未酰化花青素的影响比较Fig.4 Effect comparison of 120℃ between the acylated anthocyanins and proanidine

图5 光照对已酰化和未酰化蓝莓花青素的影响比较Fig.5 Effect comparison of light between the acylated anthoocyanins and proanidine

由图5可知，酰化的和未酰化的蓝莓花青素随光照时间的延长稳定性下降，但酰化后的蓝莓花青素的光稳定性显著高于未酰化的蓝莓花青素，光照6d时，已酰化蓝莓花青素的保留率在90%以上，而未酰化花青素的保留率已降到80%以下；光照10d后酰化花青素的保留率依然维持在80%以上，而未酰化花青素保留率为64.37%。由此可知，蓝莓花青素酰化后的光稳定性显著（p＜0.05）高于未酰化花青素，对光的耐受力也增强。

2.4 添加剂对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响

2.4.1 VC对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响 由图6可知，随着VC添加量的增加，已酰化花青素的保留率变化趋势较未添加VC的已酰化花青素呈总体升高趋势。与对照组相比，不同添加量的VC对已酰化花青素的保留率有增强作用，10h后已酰化花青素的保留率均在90%左右。由方差分析可知，添加不同浓度的VC对已酰化花青素的稳定性影响没有显著性的差异（p＞0.05），但已添加VC较未添加VC的已酰化花青素稳定性显著（p＜0.05）提高，说明适量添加VC可以增加已酰化花青素的稳定性。

图6 VC对蓝莓中已酰化花青素的影响Fig.6 Effect of VCon the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.2 蔗糖对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响由图7可知，与对照组相比，随着蔗糖添加量的增大，已酰化花青素的保留率总体呈逐渐增加趋势。当蔗糖的添加量达到30%时，已酰化花青素放置10h后保留率仍为85%以上。由方差分析可知，添加不同浓度的蔗糖对已酰化花青素的稳定性影响没有显著性差异（p＞0.05）。但当蔗糖的添加量达到30%时，已酰化花青素的稳定性显著（p＜0.05）高于未添加蔗糖的酰化花青素，说明添加适量的蔗糖可以增加已酰化花青素的稳定性。

图7 蔗糖对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响Fig.7 Effect of sucrose on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.3 葡萄糖对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响

由图8可以看出，与对照组相比，随着葡萄糖添加量的增大，已酰化蓝莓花青素的保留率也逐渐增大，当葡萄糖添加量达到30%时，已酰化花青素放置10h保留率基本在80%以上。由方差分析可知，添加不同浓度的葡萄糖对已酰化花青素的稳定性影响没有显著性差异（p＞0.05）。但当葡萄糖添加量大于10%时，较未添加葡萄糖的酰化花青素稳定性显著（p＜0.05）提高，说明添加适量的葡萄糖同蔗糖一样都可以增加已酰化花青素的稳定性。

图8 葡萄糖对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响Fig.8 Effect of glucose on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.4 苯甲酸钠对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响 由图9可知，随着苯甲酸钠添加量的增加，已酰化花青素的保留率也逐渐增加，苯甲酸钠的添加量达到1%时，已酰化花青素的保留率在90%左右。由方差分析知，添加不同浓度的苯甲酸钠对已酰化花青素的稳定性影响没有显著性差异（p＞0.05）。但当苯甲酸钠添加量大于0.25%时，较未添加苯甲酸钠的酰化花青素稳定性显著（p＜0.05）提高，说明添加适量的苯甲酸钠对花青素的稳定性有一定程度的增强作用。

图9 苯甲酸钠对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响Fig.9 Effect of sodium benzoate on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.5 柠檬酸对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响 由图10可知，在添加不同浓度的柠檬酸0~2h，与对照组相比，已酰化的花青素保留率有所下降，但仍然维持在90%以上，而随着时间的延长和柠檬酸添加量的增加，已酰化的花青素保留率较对照组有所增加。当添加量达到30%时仍然维持在85%以上。由方差分析可知，添加不同浓度的柠檬酸对已酰化花青素稳定性影响没有显著性差异（p＞0.05）。但已添加柠檬酸的已酰化花青素较未添加的稳定性显著（p＜0.05）提高，说明添加适量的柠檬酸对已酰化花青素的稳定性有一定程度的增强作用。

图10 柠檬酸对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响Fig.10 Effect of citric acid on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.5 金属离子对蓝莓中花青素稳定性的影响

图11 Na+、K+、Cu2+对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响Fig.11 Effect of Na+、K+、Cu2+on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

由图11可知，与对照组相比，不同浓度的Na+、K+、Cu2+对已酰化蓝莓花青素的保留率影响趋势大致相同，10h后已酰化花青素的保留率在75%以上。由方差分析可知，添加不同浓度的Na+、K+、Cu2+已酰化花青素的稳定性影响没有显著性差异（p＞0.05）。说明不同浓度的Na+、K+、Cu2+对花青素的稳定性无显著影响。

图12 Ca2+对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响Fig.12 Effect of Ca2+on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

由图12可知，随着Ca2+浓度的增加，蓝莓中已酰化花青素的保留率降低趋势较明显，当Ca2+浓度达到0.1mol/L时，10h后已酰化蓝莓花青素的保留率降低到75.01%，与对照组向比，花青素的保留率降低。由方差分析可知，添加不同浓度的Ca2+对已酰化蓝莓花青素的稳定性影响没有显著性性差异（p＞0.05）。但添加不同浓度的Ca2+对已酰化蓝莓花青素的稳定性较未添加的有显著（p＜0.05）降低，因此添加Ca2+对已酰化蓝莓花青素的稳定性具有破坏作用

由图13可知，浓度为0.01mol/L的Mg2+使已酰化花青素的保留率略高于对照组，而当浓度达到0.1mol/L的Mg2+则使已酰化花青素的保留率降低。由方差分析可知，添加不同浓度的Mg2+对已酰化花青素的稳定性影响有显著性差异（p＜0.05）。说明低浓度的Mg2+对已酰化花青素具有一定程度的保护作用，而大于0.1mol/L的Mg2+对已酰化花青素具有一定程度的破坏作用。与对照组相比，加入Fe3+的已酰化花青素保留率均呈现大幅度下降趋势，且Fe3+浓度越大，已酰化花青素的保留率越低，当Fe3+浓度达到0.1mol/L时，10h后已酰化花青素的保留率降到48.08%。由方差分析可知，添加不同浓度的Fe3+对已酰化花青素的稳定性影响有显著性差异（p＜0.05）。说明Fe3+对花青素的稳定性的破坏作用随浓度的增大而增加。与对照组相比，Fe2+的浓度小于0.05mol/L时，对已酰化花青素的保留率无显著影响，10h后均维持在80%左右；而当浓度达到0.1mol/L时，Fe2+会使已酰化花青素的保留率降低，10h后保留率为74.11%。由方差分析知，添加不同浓度的Fe2+对已酰化花青素的稳定性有显著性差异（p＜0.05）。说明浓度小于0.05mol/L的Fe2+对已酰化花青素稳定性影响较小，浓度达到0.1mol/L的Fe2+对已酰化花青素的稳定性具有一定的破坏作用。

图13 Mg2+、Fe3+、Fe2+对蓝莓中已酰化花青素稳定性的影响Fig.13 Effect of Mg2+，Fe3+，Fe2+on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

图14 过氧化氢对已酰化和未酰化蓝莓花青素稳定性影响比较Fig.14 Effect of H2O2on the stability comparison between acylated anthoanins and proanidine

2.6 氧化还原剂对蓝莓中已酰化和未酰化花青素稳定性的影响比较

2.6.1 过氧化氢对蓝莓中已酰化和未酰化花青素稳定性的影响比较 由图14可知，随着反应时间的延长，过氧化氢对已酰化花青素的影响显著（p＜0.05），保留率下降明显，反应物颜色变浅，是因为过氧化氢为强氧化剂，与已酰化花青素反应明显。但添加相同浓度的过氧化氢，未酰化的花青素比已酰化的蓝莓花青素保留率下降趋势快，因此，已酰化的蓝莓花青素对强氧化剂的稳定性提高。

2.6.2 亚硫酸钠对蓝莓中已酰化和未酰化花青素稳定性的影响比较 由图15可知，随着反应时间的延长，亚硫酸钠对已酰化花青素的影响显著（p＜0.05），保留率下降明显，反应物颜色变浅，是因为亚硫酸钠为强还原剂，与已酰化花青素反应明显。但添加相同浓度的亚硫酸钠，未酰化的花青素比已酰化的蓝莓花青素保留率下降趋势快，因此，已酰化的蓝莓花青素对强还原剂的稳定性提高。

Study on stability of acylated blueberries anthocyanins

ZHAO Li-yi1，2，LI Lu-ning1，2，SHEN Rui-meng1，2，ZHU Ning1，2，SUN Ai-dong1，2，*
（1.Department of Food Science，College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.Beijing Forestry University，key laboratory of Forestry Food Processing and Security，Beijing 100083，China）

The molecular modification of blueberry in this experiment was acylated by using dodecanoyl chloride. Meanwhile，these experiments studied the stabilities（temperature，illumination，additive，metal ion，strong oxidizer reducer） of anthocyanin acylation of blueberry，The studies indicated that acylated anthocyanins were improved obviously in the stabilities of temperature，illumination and strong oxidizer reducer comparing with the blueberry anthocyanin of no acylation.The experiments showed that adding different concentration gradients additive （VC，Sodium Benzoate，sucrose，glucose，sodium citrate） could improve the stabilities of acylated anthoanins.K+，Na+，Cu2+and Fe2+（concentration was lower than 0.05mol/L had no obvious affection to the acylated anthoanins’stabilities.Ca2+，Fe3+and Mg2+，Fe2+（concentration was lower than 0.1mol/L） had the destructive effects to the stabilities of acylated anthoanins.

blueberry anthocyanin；acylation；stability

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0299-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.057

2014－02－28

赵立仪（1991-），女，硕士研究生，研究方向：天然产物生理活性的开发与利用。

* 通讯作者：孙爱东（1968-），女，博士，教授，研究方向：天然产物生理活性的开发与利用。

国家自然基金资助项目（31271981）；科技部十二五课题（2012BAD31B05）。