鼠李糖乳杆菌发酵大豆酸乳工艺优化研究

杨雪娇，张予心，宋秋梅，姚 曼，张 敏，朴春红，刘俊梅，于寒松，王玉华

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118）

鼠李糖乳杆菌发酵大豆酸乳工艺优化研究

杨雪娇，张予心，宋秋梅，姚 曼，张 敏，朴春红，刘俊梅，于寒松，王玉华*

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118）

以大豆为主要原料，将鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）进行活化、驯化与保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）按一定比例混合制备发酵剂，通过单因素实验和正交实验优化确定酸豆乳发酵的生产工艺。结果通过单因素实验确定上述三个菌种按1∶0.5∶1混合作为工作发酵剂；正交实验研究结果表明影响豆乳发酵的显著因素依次为料水比、接种量、发酵时间和蔗糖添加量，最佳条件是：接种量为5%，磨制豆浆料水比为1∶8，蔗糖添加量为8%，在43℃条件下发酵5h，该条件下生产的酸豆乳，具有浓郁的风味和细腻酸甜的口感。

大豆，酸豆乳，鼠李糖乳杆菌，发酵

目前，国际公认与人体共生的益生乳酸菌主要有 ：保 加 利 亚 乳 杆 菌（L.bulgaricus）、嗜 热 链 球 菌（S.themophilus）、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosum）、双歧杆菌（B.bacterium）等。鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus），从属于乳杆菌，有抗氧化性，调节微生态平衡，增强宿主肠道抵抗力，预防和治疗腹泻，通过发酵豆乳还可以激发大豆中大豆异黄酮完全水解葡萄糖苷酶，在糖尿病动物模型中，比未经鼠李糖乳杆菌发酵的豆乳显著的降低了血糖水平，总胆固醇浓度，甘油三酯和提高抗氧化酶活性[1]；尤其本研究选用的鼠李糖乳杆菌B10通过氧化途径能够减低酒精对小鼠肝脏氧化损伤，达到修复酒精性肝损伤的作用[2]；动物和人体实验表明鼠李糖乳杆菌有一定的抑菌效果和加强免疫系统的功效，可用于各种食品，保健食品和微生态制品或药品的研制[3]。

大豆富含蛋白质，必需氨基酸，且维生素、矿物质的含量均较高，饱和脂肪酸含量则较低[4]，其中大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预防剂[5]；大豆磷脂对动脉硬化症、肝脏病、老年痴呆具有一定预防作用[6]。大豆营养丰富但由于大豆中存在的脂肪氧化酶会使豆乳产生豆腥味使得豆乳发展收到一定限制，研究表明，乳酸菌可以分解脂肪酶，从而使产品在具有较好的口感和清爽的风味下更易于人体的吸收[7-9]。

目前我国市面上利用鼠李糖乳杆菌发酵制得的豆乳产品这一领域仍是空白，本研究以东北优质大豆为主要原料，对鼠李糖乳杆菌在豆乳中进行驯化培养研究，用驯化的鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）、保 加 利 亚 乳 杆 菌（L.bulgaricus）和 嗜 热 链 球 菌（S.themophilus）混合作为发酵剂进行酸豆乳生产研究，通过研究料水比、蔗糖添加量、菌种比例、接种量、发酵温度及时间对豆乳发酵的影响，以酸乳的感官为指标确定鼠李糖乳杆菌大豆酸乳发酵最佳工艺条件，研制出具有浓郁风味的大豆酸奶。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鼠李糖乳杆菌B10[2]（L.rhamnosus）、保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）和嗜热链球菌（S.themophilus）冻干菌粉 微生物实验室保藏；大豆、白糖、脱脂奶粉 市售；碳酸氢钠 食用级。

APV2000实验型高压均质机 上海顺仪科技有限公司；BS-FD立式恒温培养摇床 苏州威尔实验用品有限公司；FE-05磨浆机 上海田岗机械制造有限公司；BCD-271TMBA海尔冰箱 海尔集团有限公司；GMSX-280B手提压力蒸汽消毒器 沈阳科瑞永兴化玻仪器有限公司；PHS-3C酸度计 上海康仪仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 大豆处理 挑选表面光泽无霉烂变质的大豆，用水浸泡12h，使大豆达到饱和状态，再用碱水浸泡[10]（0.25%NaHCO3溶液浸泡2h），钝化脂肪酶，去除豆腥味，将浸泡好的大豆及浸泡液倒入磨浆机磨浆，收取豆浆，再用120目的筛网过筛、1500r/min离心5min，加入白砂糖混合后100℃，10min煮沸，钝化脂肪 酶 ，去 除 豆 涩 味[11]，在 85℃ ，压 力 为 20MPa下 均 质5min，95℃下杀菌5min，降温至发酵温度，备用。

1.2.3 菌种活化 将鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）、保 加 利 亚 乳 杆 菌（L.bulgaricus）和 嗜 热 链 球 菌（S.themophilus）冻干菌粉按1%（体积比）分别接种于MRS液体培养基中，42℃培养，传代3次，使培养时间在12~18h内活菌数达1×109CFU/mL以上。

将1%鼠李糖乳杆菌培养菌液分别接种于含2%葡萄糖的灭菌脱脂乳（脱脂奶粉与蒸馏水质量体积比为1∶10）培养基中，42℃培养，传代2次，4℃冷藏备用。

将保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）和嗜热链球菌（S.themophilus）冻干菌粉按1%（体积比）分别接种于脱脂乳培养基中，42℃培养，传代3次，4℃冷藏备用。

1.2.4 菌种驯化 将活化后的鼠李糖乳杆菌B10接种于豆乳中进行驯化，脱脂乳与豆乳比例由1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1依次进行传代培养，驯化[12]。

1.2.5 工作发酵剂制备 各菌种按3%接种量接种上述驯化后菌种于100～300mL三角瓶豆乳中，42℃培养，鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在豆乳中凝乳后即为母发酵剂。

1.3 单因素实验

1.3.1 菌种比例对发酵产酸及感官的影响 将鼠李 糖 乳 杆 菌（L.rhamnosus）、保 加 利 亚 乳 杆 菌（L.bulgaricus）和 嗜 热 链 球 菌（S.themophilus）按0.5∶0.5∶1、0.5∶1∶1、1∶0.5∶1、1∶1∶1比例为母发酵剂以3%的量接种豆乳基质中，42℃，保温发酵3～4h，冷却，置于4℃的冰箱过夜，进行滴定酸度产酸量测定和感官评定[13]。

1.3.2 料水比对豆乳发酵的影响 大豆酸奶凝乳状态的成因是蛋白质的凝固，豆乳的浓度一定程度上决定了酸豆乳的质构。合适的豆乳浓度可以使大豆酸奶在饮用时口感细腻滑爽，料水比会对最终产品状 态 及 固 形 物 含 量 产 生 一 定 影 响[14-15]，将 泡 好 的 黄豆，分别按1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g/mL）的料水比磨浆，依次磨浆，将处理好的豆乳在20MPa下均质5min，95℃杀菌，冷却至发酵温度，无菌条件下接种量为4%，在40℃下恒温发酵6h。

1.3.3 接种量对发酵产酸的影响 接种量的选择是保持大豆酸奶具有良好口感的重要环节，豆乳中若加入菌种多，则产酸高；反之，则产酸低。但接种量并非越大越好[16]。将菌种按一定比例分别将2%、3%、4%、5%、6%的接种量接人1∶8料水比制成的豆乳中，42℃发酵4h后测定酸度，研究不同接种量对菌种发酵的影响。

1.3.4 蔗糖添加量对豆乳口感的影响 豆乳发酵中加入一定量蔗糖可以改善产品的甜酸度，使产品更符合大多数人的要求，且口感更细腻润滑。将蔗糖按2%、4%、6%、8%、10%的比例添加到料水比为1∶8磨制而成的豆乳中，接种量为5%，研究不同蔗糖添加量对豆乳质感和口感的影响。

1.3.5 发酵温度及时间对豆乳发酵的影响 按料水比1∶8制备豆乳，加入8%的蔗糖，85℃杀菌30min，冷却后按1∶0.5∶1的接种比例接种5%，分别于37、40、43、46℃下培养，每隔1h测定一次酸度。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal level of form factors

1.4 发酵条件正交实验

根据单因素实验的结果，对影响豆乳发酵的四个主要因素：料水比、接种量、蔗糖添加量、发酵时间进行正交优化，采用L9（43）正交实验设计，确定表1正交实验因素水平表，通过酸度和感官评分优选出最佳组合。

表2 酸豆乳感官评定标准Table 2 Sensory evaluation standard of fermented soymil

1.5 感官评价

1.5.1 色泽与组织状态评定 用洁净的烧杯取适量混合均匀的样品置于明亮处观察酸豆乳的色泽及其组织状态进行评定。

1.5.2 风味与滋味的品评 取到样品后立即嗅其风味，用温水漱口后再对其滋味进行品评。

由5名男生5名女生共10名学生组成感官鉴评小组，并接受感官鉴评培训。小组成员要求对发酵豆乳的表观、气味、风味和质地指标进行评价[17]。具体品评标准见表2，感官评分为100分制。

2 结果与分析

2.1 鼠李糖乳杆菌在豆乳中驯化结果

为了提高鼠李糖乳杆菌在豆乳中的生长能力和发酵性能，本研究将鼠李糖乳杆菌接种牛乳与豆乳的梯度混合物进行驯化，观察其凝乳时间、酸度和活菌数。结果见表3。

表3 鼠李糖乳杆菌驯化结果Table 3 Results of L.rhamnosus domestication

鼠李糖乳杆菌在豆乳中驯化后，凝乳时间为5h，凝乳活菌数1.1×109cfu/mL，凝乳时酸度65.3°T，驯化后的鼠李糖乳杆菌可以发酵豆乳。

2.2 菌种比例对发酵产酸及感官的影响

酸豆乳产品的酸度与感官性状与不同菌种比例的添加量有着直接关系。其中，鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus），保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）和嗜热链球菌（S.themophilus）三者的比例不同对酸豆乳的酸度，粘稠度，口感等均有一定影响。结果见表4。

表4 菌种比例对酸奶酸度和感官的影响Table 4 Effect of Strain ratio on acidity and sensory

由 表4可 知 ，当 鼠 李 糖 乳 杆 菌（L.rhamnosus），保 加 利 亚 乳 杆 菌（L.bulgaricus）和 嗜 热 链 球 菌（S.themophilus）三者的比例为1∶0.5∶1时，酸乳的酸度和感官性状均较为理想，所以作为最适比例。

2.3 料水比对豆乳发酵的影响

合适的豆乳浓度可以使大豆酸奶在饮用时口感细腻滑爽，分别按1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g/mL）的料水比磨浆，以凝乳状态和口感考察料水比对豆乳发酵的影响。

表5 料水比对豆乳发酵的影响Table 5 Effect of material to water ratio in soybean yogurt

从表5中可以看出，料水比1∶6（g/mL）的豆乳，发酵效果虽好，酸度较好，但固形物含量高，而且乳质地较硬口感较差。料水比大于1∶8（g/mL）的豆乳，凝乳状态不好，且有乳清析出，所以本实验选择最佳料水比为1∶8（g/mL）。

2.4 接种量对发酵产酸的影响

接种量低，产酸较少，接种量太高，产酸过快，凝乳过快，造成酸豆乳风味和组织上的缺陷[15]。图1为接种量对发酵产酸的影响结果。

图1 接种量对发酵产酸的影响Fig.1 Effect of inoculation amount on fermentation acid production

从图1可以看出接种量从2%上升到5%时，酸度逐渐增加。接种量从5%上升到6%时，酸度基本不变。因此选择5%的接种量为最佳的接种量。

2.5 蔗糖添加量对豆乳口感的影响

表6 蔗糖添加量对豆乳口感的影响Table 6 Effect of sucrose content on product quality

由表6可以看出添加小于6%的蔗糖，酸豆乳的口感较差，添加6%的蔗糖酸度较小，10%蔗糖，甜度偏高；添加8%的蔗糖可以使酸豆乳的乳质细腻润滑，酸度适中，优化后酸甜适口，因此8%的蔗糖最佳。

2.6 发酵时间及温度对豆乳发酵的影响

图2 发酵温度及时间对发酵产酸的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature and time on fermentation acid production

乳酸菌发酵豆乳的温度通常在37~43℃之间，不同的菌种发酵温度也不一样。

由图2可以看出在43℃以下发酵的酸豆乳在酸度随发酵时间的延长和温度的升高而增大，温度在46℃下发酵时，3h之内就基本终止发酵，且酸度在55°T左右，所以从生产成本口感风味上选择43℃下发酵5h为最佳。

2.7 正交实验结果

为了进一步优化以鼠李糖乳杆菌为主要发酵剂的酸豆乳发酵工艺条件，对料水比、接种量、发酵时间和蔗糖添加量进行了正交实验，结果见表7。

从表7的极值和Fα值可以看出，影响豆乳发酵的依次为：A料水比、B接种量、D发酵时间、C蔗糖添加量 ，其 中A因 素 Fα＞F0.05=5.14，说 明 料 水 比 对 发 酵 豆乳影响显著。酸度值辅助感官评价，酸度过高或过低都不会得到最佳感官，综合各因素得到最佳优化组合为A2B2C3D2，即接种量为5%，料水比为1∶8磨制豆浆，添加8%的蔗糖，在43℃条件下发酵5h。

从正交实验结果表中可以看出对生产产品进行感官评价，9组实验中10人感官评价平均得分为76.81分，口感评分最好的是第四组，即接种量为5%，料水比为1∶10磨制豆浆，添加8%的蔗糖，在43℃条件下发酵6h，但是料水比过大影响了豆乳的凝乳状态，且发酵5h就可以达到的口感和酸度，发酵再长时间不利于经济利益，所以通过正交实验得出的最优组合即接种量为5%，料水比为1∶8，蔗糖添加量为8%，发酵温度43℃发酵5h的条件下制取的酸豆乳，既具有浓郁的风味和细腻酸甜的口感。

3 讨论

目前，世界发达国家和地区对乳酸菌的研究已 从 以 双 歧 杆 菌（B.bacterium）和 嗜 酸 乳 杆 菌（L.acidophilus）为代表的第一代益生乳酸菌发展到以 鼠 李 糖 乳 杆 菌（L.rhamnosum）和 干 酪 乳 杆 菌（L.bacilluscasei）等在内的第二代新型益生乳酸菌，但我国对于第二代乳酸菌的应用却还很少。第二代乳酸菌的优点是，抗氧化性更强，可顺利通过胃酸环境在人体肠道定植[18]。Yuhua Wang等学者[19-21]的研究表明鼠李糖乳杆菌可以促进肠道粘膜屏障功能基因如ITF、MUCI-3及其他与缺氧反应相关的基因表达，降低了酒精引起的消化道通透性，进一步研究表明鼠李糖乳杆菌可以显著降低酒精引起的肠道内肉毒素的增加，从而显著降低了酒精性肝损伤的严重性。Miettinen等在实验中发现，鼠李糖乳杆菌能够抑制食物中革兰阴性致病菌引起的免疫功能失调，并能诱导产生较多的TNF-α、IL-6和IL-10[22]。

在豆乳发酵的研究中，杨东升[23]、贾艳萍等[24]学者采用大豆乳与牛乳按比例混合，接种保加利亚杆菌和嗜热链球菌的混合菌种进行发酵，与本研究完全采用豆乳并接种鼠李糖乳杆菌相比，由于人体中只含有L-乳酸脱氢酶，因此只能代谢L-乳酸，鼠李糖乳杆菌在发酵过程中只产生L-乳酸，不会产生对产品安全性和口感有影响的其他酸类[25]，因此本研究的酸豆乳更易于人体吸收利用且大豆中不含胆固醇；在菌种方面，贾建波[26]将燕麦粉碎灭酶后加入脱脂乳，接种鼠李糖乳杆菌（江南大学生物工程学院提供）发酵，本研究采用的鼠李糖乳杆菌B10具有更好地抗氧化性[2]。在此之前，国内的科技文献中还没有对鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）作为发酵剂生产酸豆乳的相关研究。

4 结论

本研究通过单因素和正交实验分别从菌种比例、豆浆料水比以及接种量等方面讨论了鼠李糖乳杆菌大豆酸乳发酵工艺的优化，最终通过酸度测定和感官评价确定了混合发酵剂的最佳比例及发酵参数，制得了具有浓郁风味的酸豆乳，其中对于鼠李糖乳杆菌在豆乳发酵领域的探讨，具有一定的研究价值和实际应用前景。

[1]José A MarazzaJean Guy LeBlanc，Graciela Savoy de Giori，Marisa S Garro.Soymilk fermented with Lactobacillus rhamnosus CRL981 ameliorates hyperglycemia，lipid profiles and increases antioxidant enzyme activities in diabetic mice[J].Journal of Functional Foods，2013，27（9）：46-49.

[2]王玉华，高晶，张静，等.鼠李糖乳杆菌B10通过抗氧化途径改善酒精性肝损伤的研究[J]. 食品科学，2012，33（23）：270-274.

[3]杨红梅，林汉亮.鼠李糖乳杆菌在酸奶中的应用[J].新疆畜牧业，2011，30（10）：30-32.

[4] 徐成勇.益生菌豆酸乳发酵条件的优化[J]. 食品与发酵 工业，2008，34（9）：156-162.

[5]王淑娟，张宏立，高云龙等.影响豆酸乳质量的关键因素研究[J]. 中国乳业，2008（8）：60-61.

[6] 李春红.影响豆酸乳质量的关键因素 研究[J]. 食品工业 科技，2008（17）：19.

[7]Yang HL，Zhang L.Changes in some components of soymilk during fermentation with the basidiomycete Ganoderma lucidum [J].Food Chemistry，2009，112（l）：l-5.

[8] 胡小松，蒲彪，廖小军. 软饮料 工艺 学[M]. 北京：中 国农业大学出版，2002：155-171.

[9]Granata L A.Improved acid，flavor and volatile compound production in a high protein and fiber soymilk yogurt-like product[J].Food Science，1996，61（2）：331-336.

[10]廖明星，顾振新，麻浩，等.芽大豆的营养价值及其复合乳生产技术[J]，食品与发酵工业，2003：29（8）36-38.

[11] 吐尔逊江. 豆乳除腥过程对营养价值的影响研究[J]. 中国公共卫生，2003，19（11）：1347.

[12] 傅樱 花，张富 春. 凝固 型 鹰 嘴 豆酸乳 的 发 酵工艺 研 究[J].食品与发酵工业，2008，34（9）：168-170.

[13] 吴定，路桂红. 固 定化乳酸菌 发酵大豆酸乳研 究[J]. 中国酿造，2002，（4）：15-17.

[14] 宗绪岩，李丽，边名鸿，等.凝固型发酵酸豆乳制备工艺[J].农业工程，2012，2（6）：34-36.

[15]Han Liu，Hong Guan，Qi Zhang，et al.Research on yoghurt of plant protein fermented by Bifidobacteria adolescentic[C]. International Conference on Remote Sensing.Environment and Transportation Engineering[v.10]，2011：7788-7790.

[16]Crittenden R G，Martineznr，Playne M J.Synthesis and utilization of folate by yoghurt starter cultures and probiotic bacteria[J].International Journal of Food Microbiology，2002，80：217-222.

[17]Harry T Lawless. 食品感官评价原理与技术[M]. 北京：中国轻工业出版社，2004.

[18]Alander M，Satokari R，Korpela R．Persistence of colonization of human colonic mucosa by aprobiotic strain ，Lactobacillus rhamnosus GG，after oral consumption[J].Appl Environ Microbiol，1999，65：351-354.

[19]Yuhua Wang，Yanlong Liu，Irina Kirpich，et al.Lactobacillus rhamnosus GG reduces hepatic TNFα production and inflammation in chronic alcohol-induced liver injury[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，2013，24：1609-1615.

[20]Yuhua Wang，Irina Kirpich，Yanlong Liu，et al.LGG treatment potentiates intestinal hypoxia-inducible factor，promotes intestinal integrity，and ameliorates alcohol-induced liver injury[J].The American Journal of Pathology，2011，179（6）：2866-2875.

[21]Yuhua Wang，Yanlong Liu，Anju Sidhu，et al.Lactobacillus rahmnosus GG culture supernatant ameliorates acute alcoholinduced intestinal permeability and liver injury[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，303：32-41.

[22]Miettinen M，Vuopio-Varkila J，Varkila K.Production of human tumor necrosis factor alpha，interleukin-6，and interleukin-10 is induced by lactic acid bacteria[J].Infect Immun，1996，64：5403-407.

[23]杨东升，罗先群，李辰阳.大豆代替牛乳生产发酵型酸奶工艺研究[J]. 中国食品添加剂，2006（1）：44-46.

[24]贾艳萍，郑胜，赵晴潇.大豆、牛乳发酵制作大豆酸奶的工艺研究[J].酿造与发酵，2010（5）：23-26.

[25]Jonathan E，Teitelbaum W，Allan Walker．Nutritional impactofpre-and probiotics as protectivegastrointestinalorganisms[J]. Annual Review of Nutrition，2002（22）：107-138.

[26]贾建波.鼠李糖乳杆菌燕麦益生乳的研制[J].食品工业科技，2002（10）：39-41.

Study on the optimization of fermentation conditions of Lactobacillus rhamnosus soybean yoghurt

YANG Xue-jiao，ZHANG Yu-xin，SONG Qiu-mei，YAO Man，ZHANG Min，PIAO Chun-hong，LIU Jun-mei，YU Han-song，WANG Yu-hua*
（Food Science and Engineering College，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Using soy as the main material， the Lactobacillus bulgaricus （ L.bulgaricus ） and Streptococcus thermophilus （S.thermophilus ） with the activated and domesticated Lactobacillus rhamnosus （L.rhamnosus）was prepared by a centain percentage as mixed fermentation agent，through the single factor test and orthogonal experiment to determine the fermented soymilk production process.Results of testing to determine the three strains by single factor as work by 1 ∶0.5∶1 mixed.The order of affecting the fermentation of soymilk that the orthogonal test results showed were water ratio，inoculation，fermentation time and the amount of sugar added，the best conditions were：inoculum size of 5% ，the material to water ratio in soybean yogurt of 1 ∶8，the addition of sugar 8%，43℃ under the conditions of fermentation 5h.The conditions of production of soybean yogurt，with a rich flavor and delicate sweet and sour taste.

soybeans；soybean yoghurt；L.rhamnosus；fermentation

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0184-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.032

2014－01－14

杨雪娇（1988-），女，硕士研究生，研究方向：食品微生物与功能性食品。

* 通讯作者：王玉华（1972-）女，教授，研究方向：食品微生物与功能性食品。

长春市科技计划项目（2011111）；现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-04）；国家自然科学基金项目（31101252）。