长裙竹荪子实体乙醚和乙酸乙酯提取物的化学组成分析及抑菌活性研究

邓 超，付海田，谷 鹏，胡 准，陈敬华，*

（1.江南大学无锡医学院，江苏无锡 214122，2.江南大学药学院，江苏无锡 214122）

长裙竹荪子实体乙醚和乙酸乙酯提取物的化学组成分析及抑菌活性研究

邓 超1，付海田2，谷 鹏2，胡 准2，陈敬华2，*

（1.江南大学无锡医学院，江苏无锡 214122，2.江南大学药学院，江苏无锡 214122）

依次用乙醚和乙酸乙酯为溶剂，对正己烷提取后的长竹荪子实体粉末进行索氏提取。乙醚和乙酸乙酯的提取率分别为1.57%和1.85%，然后采用GC-MS对乙醚和乙酸乙酯提取物的化学成分进行分析，图谱解析结果显示乙醚提取物中含有43种成分，占总含量的99.98%；乙酸乙酯提取物中含有73种成分，占总含量的99.56%。两种提取物对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、伤寒杆菌等均有明显的抑制作用，而乙酸乙酯提取物的抑菌效果优于乙醚。

长裙竹荪，乙醚，乙酸乙酯，化学成分，抑菌活性

竹荪又名竹荪、竹笙、竹参，是著名的食用真菌，具有香气浓郁、脆嫩爽口、味道鲜美的特点，被誉为“菌中皇后”。它隶属于真菌界、担子菌亚门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、竹荪属。据报道，该属目前共有12个种和变种[1-2]。从竹荪提取的有效成分对防癌、抗炎、抗氧化、降血脂等均具有明显疗效[3-6]。此外，竹荪还具有特异的防腐作用，能够抑制微生物的生长[7-9]。同时，对从长裙竹荪中提取的脂溶性组分的分析表明，其含有羧酸类，苷类，喹唑啉类，醛酮类，酰胺类化合物等成分[10]。本实验室的前期研究表明，竹荪子实体正己烷提取物含有55种组分，其中23种成分是首次从竹荪属中检测出来，其主要成分为：羧酸、醇、酮、倍半萜、芳香烃、酯等，并且正己烷提取物对伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌和枯草芽孢杆菌有很好的抑制作用[11]。本文将在前期工作的基础上，对正己烷提取后的竹荪子实体粉末依次用乙醚和乙酸乙酯进行索氏提取，然后采用GC-MS对提取物进行组分分析，并对其抑菌活性进行初步研究，为进一步开发利用长裙竹荪资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

长裙竹荪（Dictyophora indusiata）子实体干品 由广东无限极公司提供；正己烷、乙醚、乙酸乙酯、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、玉米粉、黄豆粉、酵母膏、MgSO4、KH2PO4、CaCl2、VB1、CMC-Na、NaCl、琼脂 均购于国药集团化学试剂有限公司；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、变形杆菌（Bacterium vulgare）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、伤寒杆菌（Salmonella typhosa）、啤 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae）、黑 根霉（Rhizopus nigricans）、总状毛霉（Mucor racemosus）由江南大学药学院微生物实验室提供。

电子天平 梅特勒托利多仪器上海有限公司；HH-8型数显恒温水浴锅 金坛市鑫鑫实验仪器厂；索氏提取器 江苏金坛市国瑞实验仪器厂；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DZF-6050型真空干燥箱、立式压力蒸汽灭菌锅、生物洁净工作台 上海博讯实业有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱 上海博讯实业有限公司；QP2010s型气质联用色谱仪 岛津国际贸易（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取流程 流程图[11-13]见图1。

图1 竹荪子实体脂溶性成分的提取流程Fig.1 Extraction procedure of lip-soluble composition from the fruiting body of D.indusiata

1.2.2 提取方法 将竹荪子实体干品剪碎后，放入组织粉碎机内粉碎成粉末状，过80目筛，称取一定量的粉末用滤纸包裹住，置于索氏提取器中，按照料液比1∶50（g∶mL）依次分别用正己烷、乙醚和乙酸乙酯进行冷凝回流萃取，收集乙醚和乙酸乙酯萃取液过滤，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至恒重，置具塞试管中4℃保存备用。

1.2.3 竹荪子实体乙醚和乙酸乙酯提取物的分离鉴定 将低温保存的竹荪子实体乙醚和乙酸乙酯提取浓缩液分别用相对应的溶剂作适量稀释。用岛津GC-MS QP2010s进行分析，NIST08和NIST08s数据库进行检索和分析，确定各组分成分，气相色谱峰面积归一法计算其各组分含量。

气相条件：Rxi-1ms柱（30m×0.25mm×0.25um）。柱温采用程序升温：初始温度120℃，保持2min，以3℃/min升温至180℃保持1min，以10℃/min升温至220℃保持5min，以20℃/min升温至280℃保持25min。分流比10∶1，柱流量1.0mL/min，进样量1.0μL。

质谱条件：70eV的EI源，离子源温度200℃，溶剂延迟时间为1.8min，m/z范围为50~750。

1.2.4 抑菌实验

1.2.4.1 培养基的配制 真菌培养基（%）：PDA培养基，含土豆20，葡萄糖2，琼脂2，pH自然。马铃薯去皮切成小块煮至用玻棒可以戳碎为止，用双层纱布过滤取汁，加葡萄糖和琼脂溶化，补水至100mL。

细菌培养基（%）：营养琼脂培养基，牛肉膏0.3、蛋白胨1.2、NaCl 0.5、琼脂1.5，pH 7.2~7.4。

液体发酵培养基（%）：CMC-Na 0.5、葡萄糖2、玉米粉1、黄豆粉1、酵母膏0.2、MgSO40.15、KH2PO40.3、CaCl20.1、VB10.1。

1.2.4.2 培养基平板制备 将配制好的各种菌株的培养基及培养皿置于高压蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30min，取出后培养基冷却至50℃，无菌操作倾注于培养皿内，每皿15~20mL。

1.2.4.3 供试菌株的准备 在无菌操作台中将供试菌种接入相对应的试管斜面培养基进行活化，细菌置37℃恒温培养箱内培养18h，霉菌25℃、酵母菌30℃培养48h。

1.2.4.4 供试菌株悬液的制备及平板接种 用接种环挑取少许霉菌孢子、啤酒酵母于装有5mL无菌水的试管内，制成菌株悬液。霉菌孢子、啤酒酵母用血球计数板计数。用接种环挑取一环细菌于5mL液体培养基中37℃培养6~8h，用梯度稀释法计数。调整菌株悬液的浓度至含孢子或菌体为106~107/mL。

1.2.4.5 供试样品的配制 分别用相应溶剂将竹荪乙醚和乙酸乙酯提取物浓缩液稀释0、2、4倍。

1.2.4.6 抑菌实验 采用琼脂平板打孔法。分别吸取菌悬液0.1mL用灭菌玻璃涂棒涂布于培养皿的固体培养基上，静置片刻，然后在平皿中用灭菌不锈钢打孔器打孔，打孔器直径6mm。用移液器吸取0.5mL不同稀释倍数的竹荪乙醚和乙酸乙酯提取物浓缩液，注入已打好的圆孔内。霉菌25℃培养48h，酵母菌30℃培养48h，细菌37℃培养18h后测量抑菌圈直径，每个组合三个重复，以无菌水做空白对照，相应溶剂做阴性对照。

1.2.4.7 最低抑菌浓度（MIC）的测定[14]依据连续稀释法，分别将乙醚和乙酸乙酯提取液（原液浓度为140.00mg/mL）稀释后，加入培养基中混匀，在平板上涂布0.1mL菌体悬液，于37℃培养18h，观察菌株生长情况。以平板中没有菌生长的最低浓度为提取液对该菌株的最低抑菌浓度（MIC）。

1.3 数据处理

统计学处理结果以平均数±标准误表示，采用SPSS 13.0软件中的单因素方差分析进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 长裙竹荪乙醚和乙酸乙酯提取物性质及提取率

乙醚提取物的得率为1.57%，呈淡黄色油状液体，pH4.0，呈清淡香味。乙酸乙酯提取物的得率为1.85%，呈黄褐色油状液体。

2.2 乙醚和乙酸乙酯提取物的化学成分解析

从长裙竹荪子实体粉末乙醚提取物和乙酸乙酯提取物中分别鉴定出43种和73种组分，占总量的99.98%和99.56%。乙醚提取物和乙酸乙酯提取物的GC-MS总离子色谱图见图2、图3，化学成分检测结果见表1、表2。

表1 长裙竹荪子实体乙醚提取物化学成分鉴定表Table 1 Chemical compositions of D.indusiata extracted with ethylether

从表1可知，长裙竹荪子实体的乙醚提取物中，检测出的主要化学成分类别及相对含量为：苷类33.27%、脂 肪 酸 类13.24% 、醛 酮 类13.72%、芳 香 类8.79%、醇类17.85%、酯类7.19%、酰胺类4.89%。其中占总提取物的32.76%的是4-硝基苯基-2，3，4，6-四乙酸基-β-D-吡喃葡萄糖苷，是首次从竹荪属中检测到。脂肪酸类、芳香类和酯类种类最多，分别有7、7和11种，占总检测组分含量的29.22%，占总组分种类的58.14%；13.72% 的 醛 酮 中 ，呋 喃 酮 占72.81% ；13.24%的脂肪酸中，不饱和脂肪酸占60.87%。表2结果显示，长裙子实体的乙酸乙酯提取物中，共检测出73种化学物质。其中醇类的种类和含量均最多，有16种，占检出物质含量的34.22%，1-三十一烷醇是首次从竹荪属中检测到，占总提取物的9.35%。其他含量较多的为脂肪酸类，共检出10种，占检出物质含量的23.55%。检出醛酮类有11种占总含量的20.89%、酯类11种占总含量10.56%、烃类12种占总含量的5.84%、芳香类6种占总含量3.19%、酚类及其他共占1.65%。综合分析表明，从长裙竹荪子实体粉末乙醚和乙酸乙酯提取物中共分离鉴别出116种化合物，其中有33种化合物是首次从竹荪属中分离鉴别出来的，其主要成分为苷类、脂肪酸类、醇类、醛酮类、酯类等。乙醚提取物和乙酸乙酯提取物中上述主要成分分别占94.06%，89.22%。

图2 长裙竹荪子实体乙醚提取物的GC-MS总离子色谱图（35℃）Fig.2 GC-MS Total ion chromatogram of D.indusiata with ethylether at 35℃

图3 长裙竹荪子实体乙酸乙酯提取物的GC-MS总离子色谱图（35℃）Fig.3 GC-MS Total ion chromatogram of D.indusiata with ethyl acetate at 35℃

表2 长裙竹荪子实体乙酸乙酯提取物化学成分鉴定表Table 2 Chemical compositions of D.indusiata extracted with ethyl acetate

据文献报道，目前从植物、真菌中提取出的有抑菌活性成分主要为脂肪酸类、酯类、醇类、醛酮类、酚类和苷类等，其抑菌机制主要是通过破坏细胞壁及细胞膜的完整性和抑制蛋白、核酸的合成等途径实现的[15]。其中脂肪酸及其衍生物可抑制丝状真菌以及酵母菌的生长，同时也可抑制细菌的生长繁殖，并且对革兰阳性细菌的抑制作用强于革兰阴性细菌，但存在菌株差异性。对鼠伤寒沙门菌、肉毒梭状芽孢杆菌、肉杆菌等其他常见致腐致病细菌也有一定的抑制作用[16]。相应的酯类也具有类似的抑菌活性，并且含有不饱和结构的酯类的抑菌效果较饱和酯类更高，且对革兰氏阳性菌的抑制作用优于革兰氏阴性菌[17]。此外不同类型的化合物的抑菌效果也有所差异，如隐丹参酮对金黄色葡萄球菌高度敏感[18]，而黄酮类对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌效果较好[19]。醇类（包括甾醇类）对金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌和苏门芽孢杆菌等有抑菌效果[20]。酚类物质的抑菌作用不仅限于细菌，对于酵母和霉菌也有效果[21]。醛类，如肉桂醛，已作为食品添加剂用来防腐杀菌，在较低浓度时，即可对黄曲霉、黑曲霉、酵母、白地霉等均有强烈的抑菌效果[22]。而在苷类中，苷元的抑菌效果高于糖苷，如金线莲中提取出来的丁酸衍生物葡萄糖苷抑菌效果不明显[23-24]。本实验中，长裙竹荪子实体粉末乙醚和乙酸乙酯提取物的主要成分为苷类、脂肪酸类、醇类、醛酮类、酯类等，根据上述文献分析，其应当对微生物的生长有抑制作用，因此，拟通过抑菌实验来进一步验证提取物的抑菌功效，并且比较两种提取物抑菌作用的差异。

续表

2.3 提取物抑菌作用

从表3可见，与空白对照组和溶剂对照组比较，样品组的抑菌圈直径有高度显著性差异（p＜0.01）。长裙竹荪子实体乙醚和乙酸乙酯提取物对细菌的生长有明显的抑制作用，其抑菌效果随浓度递减而降低，三种浓度下均对伤寒杆菌的抑菌效果最好，其次为金黄色葡萄球菌、变形杆菌和枯草芽孢杆菌，可见提取物对致病菌的抑制效果优于非致病菌。在两种提取物中，高浓度和中浓度的乙酸乙酯提取物对致病菌的抑制作用大于相同浓度的乙醚提取物，低浓度的两种提取物对致病菌的抑制作用无显著差异。而对于非致病菌，各个浓度的两种提取物的均无显著差异。此外，乙醚和乙酸乙酯提取物对总状毛霉、黑根霉、酵母菌等真菌的生长均没有抑制作用。本研究所选菌种中包含致病性革兰氏阳性无芽胞菌，致病性革兰氏阴性无芽胞菌，非致病性革兰氏阴性芽孢杆菌，非致病性革兰氏阴性无芽孢杆菌以及单细胞和多细胞真菌，长裙竹荪子实体粉末乙醚和乙酸乙酯提取物对细菌生长具有广泛的抑制作用，尤其是致病菌，而对真菌无抑制作用，这与谭敬军等[8]对长裙竹荪乙酸乙酯、丙酮、乙醇提取物的抑菌实验结果一致。但棘托竹荪的提取物[12-13，25]对霉菌、酵母菌、细菌都有效果，特别是乙酸乙酯提取物对霉菌和酵母菌的效果比对细菌要明显，说明不同种的竹荪提取物所含成分不同，其生物活性亦有差异。

2.4 提取物对各细菌菌株的MIC

表4结果显示，长裙竹荪子实体的乙醚提取物和乙酸乙酯提取物对伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC均为8.75mg/mL，对变形杆菌、枯草芽孢杆菌的MIC均为17.50mg/mL。

表3 长裙竹荪子实体乙醚和乙酸乙酯提取物的抑菌实验结果Table 3 Antimicrobial activity of the extractions with ethylether or ethyl acetate from fruiting body of D.indusiata

表4 长裙竹荪子实体乙醚和乙酸乙酯提取物对4种受试细菌的最小抑菌浓度测定Table 4 Determination of MIC of four kinds of bacteria by the extractions with ethylether or ethyl acetate from fruiting body of D.indusiata

3 结论

由于长裙竹荪乙醚和乙酸乙酯提取物的化学组分以及抑菌效果的比较研究尚未有文献报道，本实验对长裙竹荪两种有机溶剂的提取物进行了对比研究。GC-MS分析结果表明，从长裙竹荪子实体粉末乙醚和乙酸乙酯提取物中共分离鉴别出116种化合物，其中有33种化合物是首次从竹荪属中分离鉴别出来的，其主要成分为苷类、羧酸类、醇类、醛酮类、酯类等。乙醚提取物和乙酸乙酯提取物中上述主要成分分别占有94.06%，89.22%。抑菌实验显示，两种提取物对细菌生长具有广泛的抑制作用，尤其对致病菌的作用更加显著，而对真菌（包括单细胞真菌和多细胞真菌）无抑制作用。MIC测定结果表明，长裙竹荪子实体的乙醚提取物和乙酸乙酯提取物对伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC均为8.75mg/mL，对变形杆菌、枯草芽孢杆菌的MIC均为17.50mg/mL。综上可知，长裙竹荪乙醚和乙酸乙酯提取物都含有天然抑菌成分，特别是对致病菌的作用值得关注。但有机溶剂提取物的化学组成复杂，哪种（或哪几种）成分具有更强的抑菌效果及提取物的抑菌机理有待进一步深入研究。长裙竹荪乙醚和乙酸乙酯提取物作为天然产物与化学合成的防腐剂相比，具有无毒，绿色环保的优势，随着对长裙竹荪抑菌活性更深入系统的研究，有望开发出基于竹荪提取物的新型天然防腐剂，在食品防腐领域有广泛的应用前景。

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Chemical composition and antimicrobial activity of the extracts with ethylether and ethyl acetate from Dictyophora indusiata

DENG Chao1，FU Hai-tian2，GU Peng2，HU Zhun2，CHEN Jing-hua2，*
（1.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The dry fruiting body power of Dictyophora indusiata was extracted by ethylether and ethyl acetate after n-hexane extraction.The ethylether and ethyl acetate extraction rate was 1.57%and 1.85% ，respectively. The chemical composition of the extracts had been identified by GC-MS.The analysis results showed that forty-three components had been identified from ethylether extracts and their content was of 99.98%.Seventythree components had been identified from ethyl acetate extracts and their content was of 99.56%.Two kinds of extraction showed a significant antimicrobial activity to Staphylococcus aureus，Bacterium vulgare，Bacillus subtilis and Salmonella typhosa.The inhibitory effect of ethyl acetate extracts were better than that of ethylether extracts.

Dictyophora indusiata；ethylether；ethyl acetate；chemical composition；antimicrobial activity.

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0128-07

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.020

2014－03－14

邓超（1972-），男，在读博士，讲师，主要从事天然产物的提取及活性评价方面的研究。

* 通讯作者：陈敬华（1971-），男，博士，教授，主要从事生物活性大分子及生物医用材料方面的研究。

教育部博士点基金（博导类20110093110008）。