金牡丹自然杂交后代遗传差异分析

杨 军，孔祥瑞，王让剑，郑国华

（福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015）

金牡丹自然杂交后代遗传差异分析

杨 军，孔祥瑞，王让剑，郑国华

（福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015）

利用EST-SSR对茶树品种铁观音、黄棪、金牡丹及其自然杂交后代，进行初步遗传多样性和亲缘关系分析。14对EST-SSR标记共检测到等位位点62个，平均检测到4.43个，Shannon信息指数1.22，Simpson指数0.70。在相似系数0.73时，金牡丹自然杂交后代可分为4组。结果表明，第I组与铁观音亲缘关系最近，第II组与金牡丹亲缘关系最近，第II组组内遗传多样性较高；4个组间在树幅、叶片长、叶片宽等性状上达到显著性差异，每组在性状上都具有一定的群体特征。

茶树；自然杂交；EST-SSR；亲缘关系；遗传多样性

EST-SSR是基于EST序列或cDNA数据开发的一种分子标记，来自于功能基因，具有多态性高、共显性、技术简单、重复性好等特点，在遗传多样性和亲缘关系分析、关联分析、种质资源鉴定筛选中广泛应用[1-6]。同时茶树上也应用EST-SSR分子标记对野生群体资源、自然杂交后代、地方群体种进行群体结构分析。其中，周萌[7]等用27对EST-SSR引物对100份茶树野生资源和22份栽培品种进行了遗传多样性和亲缘关系的分析，认为云南野生茶树的遗传多样性丰富。余继忠[8]等利用EST-SSR标记对以福鼎大白茶、云南大叶茶品种为亲本选育的40个品种（系）与衍生品种（系）的亲缘关系及遗传背景进行了分析评估，发现以云南大叶茶为母本的品种遗传多样性比福鼎大白茶为母本的更高。王丽鸳[9]等利用48对SSR引物对来自龙井群体种的5个不同居群的91份材料进行了遗传多样性和遗传分化研究，研究认为龙井群体的遗传分化程度较低，个体间遗传分化系数FIT为0.0502，群体之间的遗传分化系数FST仅为0.0345。

金牡丹是以铁观音为母本（♀），黄棪为父本（♂），采用杂交育种法育成。2003年通过省级品种审定，2010年通过国家级品种鉴定，历经30多年的试验研究与示范应用。金牡丹品质优异，适制性广，杂种优势强，综合性状优异，香气特高、适制性特广、制优率特高，在省内外推广应用中深受生产者、消费者的喜爱[10]。本实验通过基于SSR分子标记技术，结合幼龄期性状调查，初步分析金牡丹自然杂交后代与金牡丹、铁观音、黄棪的遗传差异。

1 材料与方法

1.1 材料

参试材料为铁观音、黄棪、金牡丹和38个金牡丹的自然杂交后代，均种植于福安社口镇试验地，采集各个品种（品系）一芽二叶鲜叶，后用液氮迅速冷冻处理，保存在－70℃冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

采用改进的CTAB法[11]提取茶树基因组DNA。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行茶树基因组分子量大小检测，用756-MC型紫外分光光度计测定茶树基因组DNA的纯度（OD260/280比值）。

1.2.2 引物合成

参照文献[12-13]引物序列，序列由上海Sangon公司合成。

1.2.3 PCR扩增和产物鉴定

EST-SSR方法

PCR反应体系为：ddH2O 18.8 μL，10×Buffer 2.5 μL（Mg2+），dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上、下游primer（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL（0.5 U），模板DNA1 μL。PCR反应于美国ABI-9600型扩增仪上进行，热循环程序为：94℃预变性4 min，使模板DNA充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性45 s，不同温度条件退火60 s，72oC延伸75 s，重复35个热循环；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

扩增产物用10%的聚丙烯酰胺凝胶检测，电泳在JY-SCZ7型电泳仪（北京六一仪器厂）上进行，时间为180 min，电压设定为120V，电泳后参照Charters和Wilkinson[12]的方法银染显色。Tanon2500R凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）拍照记录。

1.2.4 数据处理

采用Sangon公司的MarkerDL2000作为分子量标记，对每一个扩增出的条带记为“1”，而无条带或不清晰的记录为“0”。所得数据输入Excel建立原始表征数据矩阵，进一步分析。运用PopGen3.2软件计算Shannon信息指数（I）和Nei's基因多样性指数（H）。运用NTSYSpc2.1中的Tree plot程序进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 提取DNA纯度情况

DNA OD260/280比值1.6～1.9，平均值为1.75，DNA纯度较好；并从图1可以看出41份材料都能扩增出稳定的多态性条带，说明提取的DNA相对较为稳定，且引物的多态性好。

2.2 不同引物等位位点及多态性分析

从表1中看出，14对EST-SSR标记在参试材料中共检测到等位位点62个，平均每对引物检测到4.43个，其中最多的（引物w05、w09）为7个，多态性十分丰富；14对引物的PIC值范围从0.37～0.81，平均值为0.61，所有挑选出来的引物的PIC值都高于0.5；14对引物Shannon信息指数的平均值为1.22，Simpson指数的平均值为0.70。说明14对引物都含有较高的多态信息量，具有很好的品种鉴定能力。

图1 41份茶树材料的PCR扩增显示出的多态性Fig. 1 Polymorphisms of 41 tea varieties by PCR amplification

表1 参试材料的扩增结果Table 1 Amplification information of tested materials

2.3 亲缘关系分析

在相似系数0.73处，38个自然杂交后代可被分为4组，第I组为铁观音与金牡丹自然杂交后代11个，与铁观音最相似；第II组为金牡丹与金牡丹自然杂交后代14个，与金牡丹最相似；第III组为金牡丹自然杂交后代7个，与金牡丹较相似；第IV组为黄棪与金牡丹自然杂交后代6个（见图1）。

由表2可见，38个金牡丹自然杂交后代与金牡丹的相似系数均值最高，为0.737，可以初步认定自然杂交后代与金牡丹亲缘关系最近，其次是铁观音、黄棪。不同的组自然杂交后代与铁观音、金牡丹、黄棪的亲缘关系有所差别，第I组与铁观音相似系数平均值为0.803，且多重比较结果表明，第I组与其它组达到显著性差异，最相似于铁观音；第II组自然杂交后代与铁观音、金牡丹、黄棪的相似系数分别为0.702、0.806、0.693，与金牡丹的相似系数最高，且多重比较结果表明，与第I组达到显著性差异，与金牡丹最相似；第III、IV组分别与金牡丹的相似系数分别为0.760、0.725，高于铁观音、黄棪的相似系数，说明与金牡丹相似。

2.4 组内遗传多样性比较

第II组、第IV组的Nei’s基因多样性相对较高，分别为0.2348、0.2492，同时Shannon信息多样性指数，分别为0.3480与0.3701，说明第II组、第IV组组内遗传多样性比第I组、第III组遗传多样性丰富；其中第III组的Nei’s基因多样性指数与Shannon信息多样性指数，分别为0.1890、0.2776，在4组中属最低，说明第III组组内遗传多样性较低（见表3）。

2.5 组幼龄期性状分析

经方差分析，4组间的树幅（F=3.2*）、叶长（F=12.59**）、叶宽（F=3.63*）、长宽比（F=2.85*）达到显著性差异。从表4多重比较结果看出，第IV组树幅、叶宽、长宽比值最高，且显著高于第II组，叶长显著高于其它3组，达到显著性差异；第I组的树幅、叶长高于第II组，且达到显著性差异；第II组的树幅、叶长、叶宽、长宽比值均最低，其中树高、树幅、长宽比与第III组未达到显著性差异。综合说明，4个组间，树幅、叶片长、叶片宽等性状上达到显著性差异，每组在性状上都具有一定的群体特征。

3 讨论

3.1 金牡丹自然杂交后代遗传分离情况

金牡丹自然杂交后代与铁观音、黄棪的相似系数值分别为0.691和0.645，说明自然杂交后代更相似于铁观音。根据相似系数聚类，可将38个自然杂交后代分为4组，4组与铁观音、金牡丹、黄棪的相似程度均有不同。其中，第I组内品系多为铁观音类型，组内遗传多样性相对较高，可供初步筛选铁观音类型的品系；第II组、第III组内品系多为金牡丹类型，但第II组与铁观音、金牡丹的相似系数均高于第III组，推测品系性状优于第III组，且组内遗传多样性高于第III组，说明第II组组内材料遗传差异较大。

3.2 幼龄期性状分析

根据分子标记聚类结果，将金牡丹自然杂交后代分为4组后，通过方差计算及多重比较分析，聚类所得的4组品系的不同组间在树幅、叶长、叶宽、长宽比等性状上均表现出了显著的差异，所以可以初步认为，EST-SSR分子标记可以用于乌龙茶品系个别性状育种选择的辅助方法。

图2 遗传相似系数聚类图Fig. 2 Dendrogram of genetic similarity coefficient

表2 4个组相似系数方差分析Table 2 Analysis of variance of similarity coefficient for 4 groups

表3 组内遗传多样性比较Table 3 Comparison of genetic diversity in the group

表4 4个组幼龄期性状比较Table 4 Comparison of morphological traits in young stage of four groups

[1] 刘振．茶树资源核心种质的构建策略研究与EST-SSR标记的初步验证[D]．北京：中国农业科学院，2008．

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Analysis of Genetic Diversity Among the Natural Hybrid Prodenies of Jinmudan （Camellia sinensis）

YANG Jun，KONG Xiang-rui，WANG Rang-jian，ZHENG Guo-hua
（Tea Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fu’an，Fujian 355015，China）

Genetic diversity and relationship among Camellia sinensis “Tie guanyin”, “Huangdan”, and “Jinmudan” and its natural hybrid prodenies, were researched with EST-ESSR markers. Using 14 EST-SSR primers, 62 alleles were generated and its average value was 4.43（ranged between 1 and 7）. The Shannon’s information index and Simpson index were 0.485 and 0.70 respectively. According to the similarity coefficient at 0.73, the natural hybrid progenies of Jinmudan could be clustered into 4 groups. From the results, Group I was a close relative of Tie guanyin. Group II was close related to Jinmudan and expressed the high genetic variation. There were significant differences in tree width, leaf length and leaf width among 4 group progenies of Jinmudan, furthermore, each group possessed a certain group characteristics.

tea plant, natural hybrids, EST-SSR, genetic relationship, genetic diversity

福建省现代农业（茶叶）产业技术体系建设项目；福建省农业科学院科技创新团队建设项目（CXTD-1-1302）；

杨军（1981-），男，硕士，助理研究员，从事茶树种质资源与遗传育种研究。