石杉碱甲－玉米醇溶蛋白微球释放特性的研究

宋韶锦，刘华丽，丁平田

（1.威海市药品检验所，山东威海264200；2.沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016）

·制剂研究·

石杉碱甲－玉米醇溶蛋白微球释放特性的研究

宋韶锦1，刘华丽2，丁平田2

（1.威海市药品检验所，山东威海264200；2.沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016）

目的建立石杉碱甲－玉米醇溶蛋白微球体外释放的测定方法，并考察载药微球的体外释放特性及影响因素。方法采用高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱：ODS－C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：pH 2.5磷酸盐缓冲液－乙腈（86∶14，V／V）；检测波长：310 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱温：25℃；进样量：20μL。将石杉碱甲载药微球加以不同的释放介质，在摇床中振荡，定时取样并补以新鲜介质，高效液相色谱法测定石杉碱甲的累积释放率，并用不同释药模型对水为介质的释放结果进行拟合。结果建立的高效液相色谱法符合方法学要求，分别以零级、一级、Higuchi以及Ritger－Peppas方程对以水为介质的释药曲线进行拟合，相关系数分别为0.693 8、

高效液相色谱法；玉米醇溶蛋白；微球；体外释放

石杉碱甲［1］（Huperzine A，HupA）是由石杉科植物千层塔中提取的一种生物碱，是现在临床上较常使用的胆碱酯酶抑制剂，主要用于治疗重症肌无力、血管性痴呆、阿尔茨海默症及良性记忆衰退。玉米醇溶蛋白［2，3］（Zein）提取自玉米，为一种安全无毒，生物相容性和生物降解性良好的天然材料，其较强的疏水性是减缓药物释放的一个重要因素。以玉米醇溶蛋白为载体的石杉碱甲微球有望降低药物的日给药次数，减少血药浓度波动，还可改善吞咽困难，记忆力差难以按时服药的老年痴呆患者的用药顺应性。本文建立了一种可靠的石杉碱甲—玉米醇溶蛋白微球体外释放实验测定方法，对载药微球的体外释

放特性进行了初步研究，考察了影响其体外释放的因素，并对体外释放实验中药物从载药微球中释放可能依从的释药模型以及释放机制进行了分析。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 高效液相色谱仪（SPD－10A VP检测器，LC10－ATVP泵，日本岛津公司）；HW2000色谱工作站（上海千谱软件有限公司）；BS 110 S型分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ－50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHZ－Ⅲ循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；WFZ UV 4802H紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；恒温气浴振荡器（天津市欧诺仪器有限公司）；pH－3C型酸度计（上海伟业仪器厂）。

1.2 试剂 玉米醇溶蛋白（江苏高邮市日星药用辅料有限公司）；石杉碱甲原料药（批号：100604；浙江万邦药业有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；乙腈（色谱纯天津市康科德科技有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（辽宁嘉诚精细化学品有限公司）；其他试剂皆为分析纯，水为去离子水。

2 方法

2.1 HPLC色谱条件［4］色谱柱：ODS－C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：pH 2.5磷酸盐缓冲液－乙腈（86∶14，V／V）；检测波长：310 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱温：25℃；进样量：20μL。

2.2 方法专属性 取空白微球溶液、载药微球释放以及石杉碱甲标准溶液分别进样20μL，记录HPLC色谱图。

结果如图1所示，石杉碱甲的保留时间为7.9 min，理论塔板数为13 403，不对称因子1.05，在测定条件下，空白微球材料等因素不干扰石杉碱甲释放的测定。

2.3 标准曲线 精密称取10 mg石杉碱甲至100 mL容量瓶中，少量甲醇溶解后以水为溶剂稀释，制备浓度分别为1、2、5、10、20 g·mL－1的石杉碱甲标准溶液，HPLC法测定主峰面积，每次进样20μL，记录HPLC色谱图。

表1 石杉碱甲标准曲线的浓度及峰面积

以浓度和峰面积做线性回归，得标准曲线：A＝35 953C－1 239.3，r＝0.999 9，可见在1～20μg·mL－1浓度范围内线性关系良好。

图1 HPLC色谱图A.空白微球；B.石杉碱甲载药微球；C.石杉碱甲

2.4 回收率 精密称取10 mg空白微球于10 mL容量瓶中，分别加入浓度为1、5、10 g·mL－1的石杉碱甲溶液定容，过滤，HPLC测定药物含量，计算回收率。

表2 回收率试验结果（n＝3）

结果表明，低、中、高3组浓度的药物溶液回收率均在98%与102%之间，符合方法学回收率要求。

2.5 精密度 取浓度为10 g·mL－1石杉碱甲溶液，连续进样6次，记录HPLC色谱图，计算日内精密度。

表3 日内精密度试验结果（n＝6）

结果表明，RSD小于2%，精密度良好，符合方法学要求。

2.6 溶液稳定性 将10 g·mL－1样品室温下放置，于0、1、6、12、24、48 h进样，记录HPLC色谱图。

表4 溶液稳定性试验结果（n＝6）

结果表明，石杉碱甲水溶液在48 h内稳定性良好。

2.7 体外释放实验方法 精密称取10 mg石杉碱甲载药微球，加以100 mL释放介质，置于摇床中，振荡转速为50 rpm。定时取样5 mL并补充新鲜介质，HPLC测定石杉碱甲浓度。

药物的累积释放率计算公式如下：

式中，Er－石杉碱甲累积释放率，%；Ve－水的置换体积，5 mL；V0－释放介质水的总体积，100 mL；Ci－第i次置换取样时释放液中的药物浓度，μg·L－1；Cn－第n次置换取样时释放液中的药物浓度，μg·L－1；Mdrug－用于释放的药量，μg。

3 体外释放实验结果与分析

3.1 释药机理研究 以水为释放介质，载药微球的释放曲线如图2所示。

图2 石杉碱甲载药微球在水中的释放结果

通过石杉碱甲载药微球体外释放曲线可以看出，药物呈现出缓释释药特征，1 h平均释放26.3%，12 h平均累积释放88.4%。分别对释药曲线进行零级、一级、Higuchi方程以及Ritger－Peppas方程拟合，拟合相关系数越大，表明药物释放动力学越接近该释药模型，各方程拟合结果见表5。

表5 不同数学模型拟合石杉碱甲微球体外释放的相关系数

结果表明Higuchi方程拟合相关系数最大，认为石杉碱甲载药微球体外释药模型为Higuchi模型。Ritger－Peppas方程中n＝0.41，小于临界值0.45，认为扩散为药物的主要释放机制。

3.2 pH的影响 选择释放介质为pH 1.0 HCl溶液、pH 4.5醋酸盐缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和去离子水，分别考察pH对药物释放的影响，结果如图3所示。

图3 不同pH条件下石杉碱甲从微球中的释放结果

石杉碱甲在上述4种介质中表现出不同的释药曲线，在pH 1的介质中释放最快，累积释放率最大，1 h累积释放34%，4 h为89%，24 h接近100%。在水中的释放次之，2 h累积释放38.4%，12 h释放90.6%。而在pH 4.5和pH 6.8的介质中释放慢于水，考虑是由于介质中离子强度的影响。

3.3 离子强度的影响 分别配制NaCl浓度为0.01、0.1、0.2、0.5和1 mol·L－1的水溶液，考察离子强度对微球体外释药的影响，结果如图4所示。

图4 不同离子强度条件下石杉碱甲载药微球在水中的释放结果

介质的离子强度对药物释放有明显影响，离子强度越高对药物释放的影响越大。0.01 mol·L－1NaCl水溶液中微球释放与在纯水介质中差异不大。增大NaCl浓度，药物释放减慢，24 h内药物的累积释放量减少。当NaCl浓度为1 mol·L－1时，药物释放呈现为零级释药曲线。

4 讨论

本文对石杉碱甲载药微球进行体外释放考察，介质的pH和离子强度均影响药物的体外释放。低pH下药物释放最快，主要是由于石杉碱甲为弱碱性药物，在低pH条件下溶解度更高。pH 6.8的介质和纯水介质的pH差别不大，但在pH 6.8 PBS中释放更慢，则考虑是离子强度不同所致，这可以从对不同离子强度条件下载药微球的体外释放的考察结果中得到解释。考察不同离子强度的水介质对药物释放的影响，1 mol·L－1NaCl水溶液释放最慢，0～24 h内呈零级释药模型。离子强度越高，微球的水分摄取过程受到限制，微球材料zein的疏水性相对更强，从而使得药物释放减慢。在高离子强度下，药物从zein微球中释放减慢的现象在文献中亦有报道［5］。Higuchi方程一般用于描述不溶性骨架中药物的扩散过程，主要包括3个阶段：水分渗透进入微球骨架内部；石杉碱甲溶解形成溶液；药物从骨架内扩散进入外部水溶液。影响微球体外释放的因素［6］包括水分的摄取、药物的溶出速率、微球粒径及骨架的溶蚀或降解速率。对石杉碱甲载药微球在水中的释药机制进行研究，zein不溶于水，使得微球在整个释放时间内不发生降解，其疏水性阻碍水分的摄取，因而会减慢药物的释放，药物通过骨架的扩散过程为药物释放的限速步骤。Ritger－Peppas方程中k为0.41，小于临界值0.45，进一步证明了扩散为药物的释放机理。

在体外释放实验中，zein未保持独立分散的单个微球状态，而是几个微球之间相互聚集。这种zein微球在释放过程中的聚集现象在其他文献中均有报道［7］，此聚集与微球粒径大小无关，而是与介质pH有关。Zein等电点PI约为6.8［8］，在水中几乎不带电荷，因其具备较强的疏水性，使得微球间会通过聚集来减少蛋白在水中的表面积以减少蛋白与水之间的自由能。

［1］刘小林，程春荣，曹威，等.石杉碱甲的药理作用与临床应用研究进展［J］.医药导报，2006，25（2）：90－95.

［2］常亮，韩恩山，胡建修，等.玉米醇溶蛋白的研究及应用［J］.化工中间体，2006，1：10－12.

［3］朱丹宇，崔莉，李大婧，等.玉米醇溶蛋白的性质、制备工艺和应用研究进展［J］.江苏农业科学，2010，6：24－26.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（二部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：110.

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［6］Liu X，Sun Q，Wang H，et al.Microspheres of corn protein，zein，for an ivermectin drug delivery system［J］.Biomaterials，2005，26（1）：109－115.

［7］Regier MC.Zein nanospheres for gene delivery［D］.Lincoln：University of Nebraska－Lincoln，2011.

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Study on in vitro release of Huperzine A Loaded Zein Microspheres

SONG Shao-jin1，LIU Hua-li2，DING Ping-tian2
（1．Weihai Institute for Drug Control，Weihai264200，China；2．Shenyang School of Pharmacy Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

ObjectiveThe purpose of this study was to research the property and effect factors of the release of huperzine－zein microspheres in vitro.MethodsAn HPLC method was established to measure the concentration of HupA in the samples.The release of huperzine A－zein microspheres in vitro was test in different mediums with a shaking table and the samples were extracted at definite times.Several models were used to fit the release result to speculate the release mechanism.ResultsThe established method would be applied for the study of the in vitro release.The correlation value r of zero order，first order，Higuchi and Rigter－Peppas was0.693 8，0.902 5，0.964 6 and 0.954 7，respectively.The release rate of HupA from the microspheres was different when pH and the ionic strength changes.ConclusionThe release mechanism of HupA－zein microspheres was most corresponded with Higuchi model.The result showed that HupA mainly diffuses from the microspheres.The pH value and ionic strength would affect the release rate of HupA due to the variations of the solubility of HupA and the relative hydrophobicity of zein respectively.

HPLC；Zein；Microsphere；In vitro release

R944.9

A

2095－5375（2014）01－0027－004

宋韶锦，女，研究方向：药物分析，E－mail：whsyjs＠sina.com

0.902 5 、0.964 6和0.954 7。介质的pH和离子强度不同，药物的释放结果不同。结论石杉碱甲－玉米醇溶蛋白微球在水中的释放符合Higuchi模型，微球中药物的释放机制以扩散为主。不同的pH和离子强度主要是分别通过影响石杉碱甲的溶解度和玉米醇溶蛋白的相对疏水性来影响石杉碱甲从微球中的释放速率。