两种美托洛尔缓释片在比格犬体内的药代动力学对比研究

李后涛，厉保秋，黄桂华，任文刚，高希波，房世红

（1.山东大学药学院，山东济南250012；2.山东弘立医学动物实验研究有限公司，山东济南250012；3.山东齐都药业有限公司，山东淄博255000）

两种美托洛尔缓释片在比格犬体内的药代动力学对比研究

李后涛1，3，厉保秋1，黄桂华1，任文刚3，高希波3，房世红2

（1.山东大学药学院，山东济南250012；2.山东弘立医学动物实验研究有限公司，山东济南250012；3.山东齐都药业有限公司，山东淄博255000）

目的研究富马酸美托洛尔缓释片的药物代谢动力学行为和缓释特性，并与已上市琥珀酸美托洛尔缓释片对比。方法采用随机交叉自身对照试验设计，对12只健康比格犬（雌雄各半）先后单次和多次灌胃富马酸美托洛尔缓释片（T药）和琥珀酸美托洛尔缓释片（R药）。采用LC－MS／MS法测定血药浓度；采用DAS 2.0药代动力学软件求算药代动力学参数；采用Excel软件进行统计分析。结果统计结果表明单次和多次口服给药，两种缓释片的AUC，t1／2，Tmax以及Cmax无显著性差异，生物等效.结论富马酸美托洛尔缓释片具有良好的缓释性。

富马酸美托洛尔；缓释片；高效液相质谱联用法；药代动力学

富马酸美托洛尔（metoprolol fumarate，MF）为美托洛尔的富马酸盐，其原料药己收载于美国药典和欧洲药典，是一种β1受体阻滞剂，β1／β2的选择性约75倍。于1969年在瑞典的Hassle实验室研发成功，自1975年阿斯利康公司以“倍他乐克”商品名上市以来，已经广泛应用于高血压和缺血性心脏病、慢性稳定性心力衰竭、心律失常等多种心血管疾病患者的治疗。目前国内上市的美托洛尔多为其酒石酸盐、琥珀酸盐，已有药学、药代比较研究支持琥珀酸盐较酒石酸盐更适合开发成缓释片，美国药学科学家协会官方刊物Pharmaceutical Research报道，富马酸美托洛尔缓释片、琥珀酸美托洛尔缓释片具有生物等效性，且与酒石酸美托洛尔相比，两个缓释产品均具有显著地缓释特性。MF在胃肠道具有高溶解性、高渗透性［1，2］。高血压、心绞痛等疾病的发病高峰期为凌晨，对于老年人来说，起床服药极为不便［3～5］。因此如果将MF制成一天给药一次的缓释片，不但可以有效克服上述问题，还有望减小血药浓度波动，减少给药次数，降低不良反应，从而提高病人顺应性。所以我们进行了富马酸美托洛尔缓释片的研究，为了评价富马酸美托洛尔缓释片与琥珀酸美托洛尔缓释片在药代动力学方面的异同，我公司

委托山东弘立医学动物实验研究有限公司进行非临床试验研究。采用液相－二级质谱联用（LC－MS／MS）法对比格犬富马酸美托洛尔缓释片与琥珀酸美托洛尔缓释片单、多次灌胃给药的药代动力学进行对比研究［6，7］，以验证该制剂的缓释特征，以期为MF的该种制剂的临床开发及应用提供依据。

1 仪器、试剂和实验动物

1.1 仪器 TCS－150A（731型）电子计重计数称；Agilent1200液相系列：G1329A柱温箱；G1311A自动进样器；G1322A泵；Agilent 6410三重四级杆质谱；XW－80A漩涡混合仪；Milli－Q超纯水机；Mettler Toler AL204电子天平；H1850台式高速冷冻离心机；海尔DW－86L386超低温冰箱；LD5－2A离心机。

1.2 试剂与药品 甲醇（色谱纯，Tedia）；乙腈（色谱纯，Fisher Scientific）；水（超纯水）；甲酸（色谱纯，Sigma－Aldrich）；富马酸美托洛尔缓释片（山东齐都药业有限公司，95 mg／片，批号：111001）；琥珀酸美托洛尔缓释片（阿斯利康制药有限公司，95 mg／片，批号：ML5588）。

1.3 实验动物 健康比格犬12只（雌雄各半），普通级，6.1～6.6 kg，年龄为7～9月，济南立秋实验动物繁殖中心，许可证号：SCXK（鲁）20070024。实验前禁食12 h。

2 方法和结果

2.1 试验方案及血样采集

2.1.1 单次给药方案 将检疫饲养两周的6只健康普通级比格犬随机分成两组，交叉灌胃供试品片（1～3号犬）和对照品片（4～6号犬）各95 mg；试验前比格犬禁食12 h，给药4 h后统一进食。第1次样品采集结束2周后，两组自身交叉给药。给药前（0 h）及给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、14、18、24、30、36和48 h共15个时间点，静脉采血约2.0 mL，置抗凝（肝素）采血管中，立即3 000 rmp离心（30 min内）取血浆，－50℃冷冻保存。

2.1.2 多次给药方案 单次给药结束3周后，与另外6只健康普通级比格犬随机分成两组，分为富马酸美托洛尔多次给药组，琥珀酸美托洛尔多次给药组，每组雌雄各半（1～3号比格犬为雄性，4～6号为雌性）。多次给药组连续给药7 d，于给药第4天、第5天、第6天前，第7天给药前（0 h）及给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、14、18、24、30、36和48 h共15个时间点，静脉采血约2.0 mL，置抗凝（肝素）采血管中，立即3 000 rmp离心（30 min内）取血浆，－50℃冷冻保存。

2.2 血浆样品测定

2.2.1 色谱条件 流动相：乙腈－水（0.1%甲酸）＝40∶60；流速：0.3 mL·min－1；柱温：30℃；进样量：3μL；Zorbax RX－C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，5μm）；Zorbax SB－C8预柱（2.1 mm×12.5 mm，5μm）；采样时间3 min。

2.2.2 质谱条件 ESI离子源，离子源温度：350℃；干燥气流速：10.0 L·min－1；雾化气压力：40.0 psi；美托洛尔检测离子：268.2→116.2，普萘洛尔检测离子：260.2→116.2；碎片均为135；碰撞能量：美托洛尔为20，普萘洛尔为22。

2.2.3 血浆样品预处理 精密量取血浆0.5 mL，加入50μL普萘洛尔内标溶液（23.667 ng·mL－1），加入0.5 mL氢氧化钠溶液（1 mol·L－1），涡旋约10 s，加入正己烷－二氯甲烷（4∶1）混合溶液4 mL，涡旋震荡提取约1 min，离心10 min（3 000 rmp），吸取上层有机相3 mL，在37℃水浴中以氮气流吹干，残渣用100μL甲醇溶解后，加入流动相100μL，涡旋约10 s，取上清液于棕色进样瓶中，自动进样3 μL分析。

2.3 分析方法的验证

2.3.1 专属性 分别取6只犬的空白血浆0.5 mL，不加内标按“2.2.3”样品处理方法进行处理，得空白血浆色谱图；将一定浓度的标准溶液和内标溶液加至空白血浆中，依同法操作，得血浆外加标准品及内标色谱图；犬给药后血浆样品，依同法操作，得血浆样品色谱图。结果表明，血浆中的内源性物质不干扰美托洛尔及普萘洛尔的测定，血浆的空白色谱图、血浆外加标准品及内标色谱图、血浆样品色谱图谱图参见图1，美托洛尔及普萘洛尔的保留时间分别为1.33 min及1.61 min。本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中美托洛尔的浓度，灵敏度较高。

2.3.2 标准曲线和线性范围 取犬空白血浆0.45 mL，加入标准系列溶液得空白血浆中美托洛尔的浓度分别为0.045、0.179、1.436、2.872、5.743、11.486、22.972和45.944 ng·mL－1，加入23.667 ng·mL－1普萘洛尔内标溶液50μL，按“2.2.3”所述的方法进行处理后分析。以美托洛尔与普萘洛尔浓度的比值为横坐标，美托洛尔与普萘洛尔检出信号比值纵坐标作图，并进行回归运算，得标准曲线方程为：A＝1.435 6C＋0.061 0，R2＝0.999 7，在0.045～45 ng·mL－1范围内线性关系良好。

图1 美托洛尔（A）及普萘洛尔（B）在犬血浆中的色谱图（从左至右依次为血浆空白、血浆外加美托洛尔及普萘洛尔、血浆样品）

2.3.3 提取回收率 取犬空白血浆0.45 mL，分别加入0.897、114.859、367.55 ng·mL－1的美托洛尔50μL，使得空白血浆中美托洛尔的浓度为0.089 7，11.486，36.755 ng·mL－1，加入23.667 ng·mL－1普萘洛尔内标溶液50μL，按“2.2.3”所述的方法进行处理后进样分析。另取犬空白血浆0.5 mL，按“2.2.3”所述的方法进行处理后进样分析。

结果表明，本法测定犬空白血浆中0.089 7、11.486、36.755 ng·mL－1浓度药物的回收率在80%～94%。

2.3.4 精密度 取犬空白血浆0.45 mL，按照“2.3.2”项下方法配制美托洛尔低、中、高不同浓度的血浆样品，按“2.2.3”所述的方法进行处理后进样分析。每个浓度5个样本，连续测定3 d，根据当日的标准曲线，计算QC样品的测定浓度，根据QC样品结果计算精密度。

结果表明，日内精密度最大为5.09%；日间精密度最大为5.15%，均小于15%。

2.3.5 定量限和检测限 在选定的色谱条件下，取不同浓度的美托洛尔对照溶液进样，按实验所用色谱条件以信噪比（S／N）3∶1记为检测限，以信噪比（S／N）10∶1记为定量限。最终实验测定美托洛尔的定量限为0.044 9 ng·mL－1，检测限为0.013 7 ng ·mL－1。

2.4 血浆稳定性实验 以空白血浆样品配制美托洛尔浓度分别为0.897、114.859、367.55 ng·mL－1的血浆标准溶液，分别于室温下放置3 h，按“2.2.3”项下血浆样品处理方法提取，评价短期室温放置条件下样品的稳定性；于冰箱－20℃贮存4 h取出室温解冻，按同法处理，然后再把样品放回冰箱－20℃贮存4 h，然后再解冻提取，评价冻融稳定性（共2次）；于冰箱－20℃贮存，于第0、2、7天取出室温解冻，按“2.2”项下血浆样品处理方法，评价冻存稳定性。

结果表明美血浆样品室温放3 h，冻融2次，冻存7 d均较稳定，相对标准差均小于15%。

2.5 实验结果 比格犬单次和多次灌胃富马酸美托洛尔缓释片与琥珀酸美托洛尔缓释片后平均药－时曲线分别见图2和图3。

图2 比格犬单次灌胃富马酸美托洛尔缓释片与琥珀酸美托洛尔缓释片后平均药－时曲线（每只95 mg·d－1，n＝6，雌雄各半）

采用Excel软件计算血浆药物浓度均值，标准差（SD或S），相对标准差（RSD），相对偏差（RE）；

采用DAS 2.0程序统计矩方法求算药代动力学参数，计算生物等效性，结果见表1。

图3 比格犬多次灌胃富马酸美托洛尔缓释片与琥珀酸美托洛尔缓释片后平均药－时曲线（每只95 mg·d－1，n＝6，雌雄各半）

将所得到的主要的药物动力学参数进行方差分析和t检验，结果表明两种制剂单次给药和多次给药，以及两种药物单次给药和多次给药的药物动力学参数之间AUC和MRT之间均无限制性差异（P＞0.05），这提示富马酸缓释片具有一定的缓释特性。

表1 比格犬单次、多次灌胃每只给予95 mg·d－1富马酸美托洛尔缓释片及琥珀酸美托洛尔缓释片的药代动力学参数（±s，n＝6）

表1 比格犬单次、多次灌胃每只给予95 mg·d－1富马酸美托洛尔缓释片及琥珀酸美托洛尔缓释片的药代动力学参数（±s，n＝6）

注：T药与R药单次各参数相比，T药与R药多次给药各参数相比，T药单次与多次各参数相比，R药单次与多次相比各参数无显著差异（P＞0.05）

富马酸美托洛尔缓释片 琥珀酸美托洛尔缓释片参数 单位2.828±0.373单次给药 多次给药921.807±209.894 AUC0～t μg·L－1·h 879.465±82.962 928.721±101.554 896.840±201.283 949.140±213.752 AUC0～∞ μg·L－1·h 882.805±81.024 932.677±102.268 897.943±201.791 951.061±213.038 MRT0～t h 8.332±0.937 7.694±0.937 8.183±1.661 7.929±0.608 MRT0～∞ h 8.532±1.106 7.910±0.986 8.236±1.709 8.042±0.612 t1／2z h 6.864±1.622 7.045±1.815 4.473±0.742 6.123±3.316 Tmax h 3.500±0.548 3.167±0.983 3.167±0.408 3.500±1.517 CLz L·h－1 108.430±10.728 102.916±11.635 110.372±24.937 104.115±23.207 Vz L 1 080.431±301.333 1 060.525±386.703 711.973±182.822 957.127±616.998 Cmax μg·L－1 101.324±21.990 104.684±23.852 98.363±15.828 115.024±22.479 DF —— —— 2.800±0.725 ——单次给药 多次给药AUCss μg·L－1·h —— 890.955±89.284 ——

3 讨论

3.1 关于血药浓度测定方法 本试验采用液液萃取法提取比格犬血浆中美托洛尔，LC－MS／MS法测定血药浓度，目前国内尚无相关文献报道。方法学考察结果表明，此方法简单快速，灵敏准确，能适用于测定富马酸美托洛尔缓释片和琥珀酸美托洛尔缓释片在比格犬血浆中的血药浓度。

3.2 关于药代动力学参数 经配对t检验，单次灌胃给药参比制剂R药和试验制剂T药的主要药代动力学参数AUC0～t、Cmax无明显差异（P＞0.05）。两种制剂的对数值按多因素方差分析结果表明，AUC0～t、Cmax制剂间、周期间和个体间均无差异（P＞0.05）。以AUC0～t对数值采用双向单侧t检验，计算出90%置信区间为83.5%～119.2%，在此区间内，同时求得tH＝2.698，tL＝2.640；Cmax对数值采用双向单侧t检验，计算出90%置信区间为92.5%～112.5%，在此区间内，求得tH＝5.786，tL＝6.697；对Tmax真值采用配对Wilcoxon法检验，可知，两制剂Tmax无差异；提示相对生物利用度为101.2%±18.8%，富马酸美托洛尔缓释片（T药）与琥珀酸美托洛尔缓释片（R药）比格犬单次灌胃给药后生物等效。

多次灌胃给药后，T药与R药达峰时间Tmax相近（3.167 h vs 3.500 h，P＞0.05），C相近（104.684μg·L－1vs 115.024μg·L－1，P＞0.05），T药t1／2z与R药相近（7.045 h vs 6.123 h，P＞0.05），平均稳态血药浓度Cav相近（37.123 vs 38.720，P＞0.05）。多次灌胃T药及R药，主要药代动力学参数AUC、Cmax、Tmax、t1／2z之间无显著性差异；6只比格犬的血药浓度均呈稳态。

4 结论

本研究表明，富马酸美托洛尔缓释片具有显著的缓释特征，在有效防治高血压等疾病的同时，明显降低药物在循环系统中的血药浓度峰值，减小了血药浓度的波动，在体内无蓄积作用，有望减少了药物的不良反应，有很高的临床应用价值，期望能够为该制剂的开发提供依据。

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Pharmacokinetics of different Metoprolol Fumarate Sustained－release Tablets in beagle dogs

LI Hou-tao1，3，LI Bao-qiu1，HUANG Gui-hua1，REN Wen-gang3，GAO Xi-bo3，FANG Shi-hong2
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Shandong Hongli Medical Animal Experimental Research Co.，Ltd.，Jinan 250012，China；3.Shandong Qidu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Zibo 255000，China）

ObjectiveTo investigate the pharmacokinetics and the sustained－released characteristics of Metoprolol Fumarate Sustained－release Tablets in beagle dogs.MethodsTwelve beagle dogs were given single dose and multiple dose of fumarate sustained－release tablets and succinate metoprolol sustained－release tablets according to the randomized cross－cover design.The metoprolol concentration in plasma was determined by the LC－MS／MS method.The main pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software and the statistical analysis was performed by the excel program.ResultsThe statistical analysis showed that the AUC，t1／2，Tmaxand Cmaxwere no significantly different between the sustained－release tablets of metoprolol fumarate and succinate metoprolol.ConclusionMetoprolol Fumarate Sustainedrelease Tablets possessed excellent sustained release performance.

Metoprolol fumarate；Sustained－release tablets；LC－MS／MS；Pharmacokinetic

R969.1

A

2095－5375（2014）01－0005－005

李后涛，男，研究方向：药剂学，E－mail：lihoutao456＠163.com