CD44在不同肿瘤细胞表面阳性表达率的实验研究

王 珏，沈 雁，张俊玲，涂家生

（1.中国药科大学药学院药剂学教研室，江苏南京210009；2.江苏省苏北人民医院肿瘤科，江苏扬州225001）

·实验研究·

CD44在不同肿瘤细胞表面阳性表达率的实验研究

王 珏1，沈 雁1，张俊玲2，涂家生1

（1.中国药科大学药学院药剂学教研室，江苏南京210009；2.江苏省苏北人民医院肿瘤科，江苏扬州225001）

目的检测CD44在肿瘤细胞表面的阳性表达率，为以CD44为靶点的肿瘤靶向治疗提供新的理论依据。方法 采用流式细胞术检测HCT116人结肠癌细胞，SGC－7901、MGC－803胃癌细胞，A549人肺腺癌细胞，HepG2人肝癌细胞，CNE－2人鼻咽癌细胞，U87MG恶性胶质瘤等肿瘤细胞表面CD44表达情况。结果各肿瘤细胞表面均表达CD44。其中胃癌SGC－7901、MGC－803、肝癌HepG2、鼻咽癌CNE－2细胞表面CD44细胞的阳性率分别为17.90%±1.67%、18.36%±9.27%、24.61%±4.0%和19.03%±1.52%，呈高表达状态。结论SGC－7901、MGC－803、HepG2、CNE－2细胞与HCT116、A549和U87MG细胞表面CD44阳性表达率相比有显著性差异（P＜0.05）。

CD44；肿瘤靶向；流式细胞术；阳性表达率

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，是导致手术、放疗、化疗等手段失败和患者死亡的最主要原因，其中细胞黏附分子参与整个过程并起重要作用［1］。CD44是一种细胞表面黏附分子，在淋巴细胞、成纤维细胞和增生的上皮细胞中都可检测到其存在。近年来发现，CD44分子与许多恶性瘤的侵袭和转移有着密切的联系，在这些恶性瘤细胞表面，CD44分子都有异常表达［2，3］。

本文将测定几种常见肿瘤细胞表面的CD44表达情况，为开发CD44介导的肿瘤靶向给药系统奠定基础。

1 材料和试剂

HCT116，SGC－7901，MGC－803，A549，HepG2，CNE－2，U87MG细胞株均由中国药科大学药理教研室提供；RPMI1640培养液、DMEM培养液均购自Gibco公司；FITC标记的鼠抗人CD44单克隆抗体，FITC标记的鼠抗人CD44同型对照抗体均购自Sigma公司；二氧化碳培养箱（美国Thermo Scientific公司）；Facscal流式细胞仪（美国BectonDickinson公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 人结肠癌HCT116和脑胶质瘤U87MG细胞用含有10%胎牛血清、100 U·mL－1青霉素和100μg·mL－1链霉素的DMEM／F12培养液常规培养，人胃癌SGC－7901、MGC－803细胞和人非小细胞肺癌A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI－1640培养基常规培养，人肝癌HepG2细胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养，人鼻咽癌CNE－2用内含10%新生牛血清、200 U·mL－1青霉素、200μg·mL－1链霉素的RPMI－1640培养。培养条件均为5%CO2、37℃、饱和湿度。所有实验细胞均取自对数生长期。

2.2 流式细胞术鉴定细胞表面CD44的表达0.25%胰酶分别消化处于对数生长期的HCT116、SGC－7901、MGC－803、A549、HepG2、CNE－2、U87MG细胞，显微镜下观察。细胞呈单细胞悬液时用含血清的培养液终止消化，200×g离心5 min，弃上清，再用适量PBS洗涤3遍计数，所有细胞均按每管约106个细胞的比例，收集至2个Eppendorf管中。各肿瘤细胞实验组加入适量鼠抗人CD44单克隆抗体，对照组加入等体积CD44同型对照抗体，室温避光放置15～30 min，PBS洗涤2遍，500μL PBS重悬，移至流式管中上机检测，收集104个细胞，荧光强度以对数放大，结果用CD44细胞的阳性率表示，数据用软件进行分析。

2.3 统计学方法 采用Sigmaplot软件对数据进行统计分析，结果用±SD表示，采用单因素方差分析（One－way，ANOVA）进行各组间均数比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

如图1－7所示，各肿瘤细胞表面均表达CD44。其中SGC－7901、MGC－803、HepG2、CNE－2细胞表面CD44细胞的阳性率分别为17.90%±1.67%、18.36%±9.27%、24.61%±4.0%和19.03%±1.52%，呈高表达状态（图8）。与HCT116，A549和U87MG细胞表面CD44阳性表达率相比有统计学意义（P＜0.05）。

图1 HCT116细胞CD44阳性表达率分布图

4 讨论

最新研究发现，CD44还被广泛作为乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌等多种肿瘤干细胞的一个重要表面标记分子。另有研究发现，CD44似乎对所有类型的癌症具有显著的调节作用，更阐明这个标记可能有助于评估其预后的重要性［4］。

另外，在药学研究领域，CD44作为肿瘤靶向给药系统的靶点已被众多研究者所关注，其特异性受体透明质酸（HA）作为主动靶向基团被引入各类给药系统，如以脂质体为基础的纳米载体［5］、阳离子聚合物基因载体［6］、自组装纳米粒［7］等，尤其随着近年来对肿瘤干细胞的研究逐渐深入，以CD44为代表的各类细胞表面黏附分子被用于多种肿瘤干细胞的分离、鉴定和纯化。因此，研究并探索CD44在各种细胞系中阳性表达率的高低可使肿瘤靶向给药系统的设计更加具有针对性。

经研究发现在实体肿瘤边缘组织富集透明质酸，同时肿瘤细胞表面则高度表达透明质酸受体－CD44

［8，9］。这提示透明质酸经过受体介导信号传导途径对肿瘤的生长、黏附、转移起着重要的作用。在恶性肿瘤细胞表面的CD44受体对透明质酸具有很高的亲和力，能将其结合后介导胞吞作用将其内吞，从而达到向肿瘤外周组织侵犯及远处转移的目的。CD44受体也表达于正常组织原代细胞中，但正常组织原代细胞的CD44受体大部分处于一种非活化的沉默状态，其对透明质酸的亲和力远低于肿瘤细胞［10，11］。实体肿瘤与透明质酸的这种关系，正好为化疗药物的靶向性输送提供一种可能的途径，即通过透明质酸与CD44受体结合介导的胞吞作用将药物靶向性送入肿瘤细胞内。

图2 SGC－7901细胞CD44阳性表达率分布图

图3 MGC－803细胞CD44阳性表达率分布图

图4 A549细胞CD44阳性表达率分布图

图5 HepG2细胞CD44阳性表达率分布图

图6 CNE－2细胞CD44阳性表达率分布图

图7 U87－MG细胞CD44阳性表达率分布图

文献报道多数肿瘤细胞CD44表达阳性率在60%以上，有些甚至达到99%。本研究未得出相同结论，这可能跟细胞培养时的传代次数有关，传代次数越多，细胞变异和恶化程度越严重，CD44的表达会有所改变，但传代次数太多会导致细胞贴壁效果下降，影响实验效果。本研究所用肿瘤细胞种类偏少，其他肿瘤细胞类型尚未涉及，有待进一步探索。

综上所述，CD44在胃癌、肝癌、鼻咽癌中呈相对高表达，在肺癌、结肠癌、脑癌中成相对低表达。这对设计CD44介导的靶向肿瘤给药系统奠定了研究基础。

图8 CD44在肿瘤细胞中的表达（n＝3）

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Analysis on the express of surface adhesion molecule CD44in different tumor cells

WANG Jue1，SHEN Yan1，ZHANG Jun-ling2，TU Jia-sheng1
（1.Department of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Department of Oncology，Subei People′s Hospital of Jiangsu Province，Yangzhou 225001，China）

ObjectiveTo detect the expressions of surface adhesionmolecule CD44in tumor cells in order to provide a new theoretical reference for CD44tumor targeted therapy.M ethodsThe expressions of CD44of HCT116，SGC－7901，MGC－803，A549，HepG2，CNE－2 and U87MG cellswere determined by flow cytometry.ResultsCD44was all expressed on these tumor cells.CD44was over expressed on SGC－7901，MGC－803，HepG2 and CNE－2 and the positive expression rate were 17.90%±1.67%，18.36%±9.27%，24.61%±4.0%and 19.03%±1.52%，respectively.ConclusionThere was significant difference between the positive expression rate of SGC－7901，MGC－803，HepG2，CNE－2 and HCT116，A549，U87MG（P＜0.05）.

CD44；Tumor targeted；Flow cytometry；Positive expression rate

R730.23

A

2095－5375（2014）02－0063－005

中央高校基本科研业务费专项基金资助项目（No.JKPZ2013006）；国家自然科学基金资助项目（No.81072588，81201182）

王珏，女，研究方向：基因给药载体及递送系统，E－mail：myxwj2007＠163.com

涂家生，男，教授，研究方向：药物新剂型与新技术，Tel：13605159819，E－mail：jiashengtu＠cpu.edu.cn