沈阳地区奶牛乳房炎细菌分离鉴定与优势菌株药敏试验

孙芳芳，何剑斌

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866）

沈阳地区奶牛乳房炎细菌分离鉴定与优势菌株药敏试验

孙芳芳，何剑斌⋆

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866）

为更好地制定奶牛乳房炎防治措施，本研究采集了沈阳地区6个奶牛场289头临床型乳房炎患牛的乳样进行细菌的分离鉴定，共分离得到4类9种细菌共计354株细菌，主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌，并对高发的大肠杆菌菌株进行了19种常见抗生素的药敏试验，发现其对哌拉西林、氧氟沙星等高度敏感，对克林霉素、万古霉素等高度耐药。

奶牛乳房炎；细菌分离鉴定；大肠杆菌；药敏试验

奶牛乳房炎是奶牛最常见、最多发且经济损失最大的疾病，该病广泛存在于世界各地，是一个世界性的问题。发生乳房炎会造成奶牛的乳腺组织不同程度的损失或破坏，泌乳量大幅减少，乳品质下降，所含细菌也会危害饮用者的健康[1-2]。目前对奶牛乳房炎的防治措施主要集中在抗生素治疗上，由于诸多原因，导致抗生素的滥用现象十分严重，耐药菌株层出不穷，治疗过程中效果不佳，成本增加，还会引起乳中药物残留，对公共卫生以及食品安全造成一定的隐患。本研究采集了沈阳地区部分奶牛场临床型乳房炎的奶样，对其中引起乳房炎的细菌进行分离鉴定，并对主要细菌的耐药性进行研究，旨在对引起本地区乳房炎的细菌进行系统的研究，为乳房炎的有效防治提供科学依据。同时为进一步的分子流行病调查提供材料。

1 材料与方法

1.1 培养基和生化试剂培养基：营养琼脂、哥伦比亚血琼脂基础、营养肉汤、肉浸液、麦康凯琼脂、伊红美兰琼脂、DHL琼脂、MH(A）培养基等购自北京奥博星生物技术有限公司；甘露醇氯化钠琼脂、缓冲葡萄糖蛋白胨、OF培养基、西蒙氏柠檬酸盐、40%胆汁肉汤、动力-吲哚-尿素培养基等购自杭州天和微生物试剂有限公司。

生化试剂：脱纤绵羊血购自南京便诊生物科技有限公司；革兰氏染色液、吲哚试剂、VP甲液、VP乙液、甲基红试剂、马尿酸盐试剂等购自杭州天和微生物试剂有限公司。

生化反应管：七叶苷、马尿酸钠生化管、水杨素、山梨醇、麦芽糖、木糖、pH9.6肉汤、6.5%高盐肉汤、苦杏仁苷、阿拉伯糖、棉籽糖、山梨醇、肌醇、DNA、鸟氨酸、氨基酸脱羧酶、血清菊糖、胆汁七叶苷、鼠李糖、硫化氢、蜜二糖、枸橼酸盐、β-半乳糖苷（ONPC）、紫牛乳、水杨酸、硝酸盐（还原）、0.1%美兰牛乳等购自杭州天和微生物试剂有限公司。

药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 乳样采集根据乳房炎判定标准[3]，分别从沈阳周边6个奶牛场采集临床型乳房炎奶样289份，患牛均处于泌乳期。采样前，用温水清洗乳房后用75%酒精进行消毒，弃去头三把奶以排除环境微生物的污染[4]。将采集奶样收集在装有2 mL灭菌营养肉汤的小试管后，封装，标记牛号，带回实验室后37℃培养18 h后进行分离鉴定。

1.3 细菌的分离鉴定用接种环取培养后的菌液1铂耳环在绵羊血琼脂平板上划线接种，观察培养24～72 h。取形态与溶血环不同的单个菌落划线接种于普通琼脂，并涂片革兰氏染色镜检，反复此过程直到培养出单个纯菌落。对于在普通琼脂上不生长的菌株，则继续用血琼脂平板划线纯培养。

将纯培养菌落分别划线接种于高盐甘露醇培养基、麦康凯培养基，根据镜检结果、培养特性与选择性培养基初步判定，将分离纯化的细菌分别进行不同的生化鉴定试验。其中对在高盐甘露醇生长，在麦康凯不生长的短杆菌，利用葡萄球菌科细菌生化编码手册进行鉴定；对在麦康凯生长，在高盐甘露醇不生长的球菌，利用肠杆菌属细菌生化编码册进行鉴定；以《常见细菌系统鉴定手册》《伯杰细菌鉴定手册》[5-7]等为依据，对其他细菌进行鉴定。

1.4 主要细菌药敏试验为保证分离鉴定的准确性，将分离得到的优势菌株送上海生工进行16srNA测序，结果正确后进行药敏试验，采用国际通用的KB纸片扩散法[8]。取纯培养菌落接种于营养肉汤中，37℃培养18～24 h，对达到0.5麦氏比浊度的菌液进行药敏试验。用灭菌长棉签沾取菌液，并在试管壁轻轻按压以挤出多余菌液，用长棉签均匀涂布MH琼脂平板，待琼脂表面干燥后，将药敏片用无菌镊子等距离贴在琼脂平板上[9]。37℃培养24 h后，用游标卡尺测量抑菌环直径，依据NCCLS抗菌药物药敏纸片判断标准和解释，判定其对各类药物的敏感性，分别记做高度敏感（S），中度敏感（I），耐药为（R）。

2 试验结果与分析

2.1 主要细菌分离鉴定结果从289份临床乳房炎患牛奶样中共检出4类19种细菌，共计354株。细菌种类分别为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、化脓链球菌、表皮葡萄球菌、其他革兰氏阳性杆菌、志贺菌属、木糖葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、产酸克雷伯氏菌、腐生葡萄球菌、牛棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、粪链球菌、产气芽胞梭菌、变形杆菌属。其中大肠杆菌63株，占比19.7%；金黄色葡萄球菌49株，占比15.4%，无乳链球菌39株，占比12.2%。266份样本检出单一细菌，占比92.0%，21份样本检出2～3种细菌，占比7.2%，2份样本无检出。

结果表明，感染奶牛乳房炎的病原微生物主要为大肠杆菌，其次为金黄色葡萄球菌与无乳链球菌。奶牛乳房炎的发病多以单一感染为主，由两种或两种以上细菌混合感染的情况相对较少。

2.2 大肠杆菌生物学特性鉴定结果见表1。

表1 大肠杆菌主要生物学特性Table1 The main biological characteristics of E.coli

大肠杆菌不同菌株的生化反应结果并不相同。符合枸橼酸盐、吲哚、与葡萄糖产气标准判定结果的大肠杆菌的比例低于90%，差异性较大。甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、木糖、H2S的结果符合率为100%，无差异。

2.3 大肠杆菌药敏试验结果见表2。

表2 大肠杆菌药敏试验结果Table2 Results of E.coli susceptibility test %

从表2中可以看出，大肠杆菌对临床常用的抗生素均产生了不同程度的耐药性，其中耐药程度最高的分别为克林霉素、万古霉素、青霉素，耐药率分别为78%、75%、65%。对哌拉西林、氧氟沙星、链霉素、诺氟沙星有较高的敏感性，敏感度分别为75%、72%、66%、66%，可作为临床参考用药。

3 讨论

奶牛乳房炎由多种病原微生物引起，不同地区、同一地区不同奶牛场的发病情况也有所不同[10-11]，这也是进行区域乳房炎流行病学调查的根本出发点。在对沈阳地区289份的奶样的病原微生物进行分离鉴定后，发现大肠杆菌的检测率超过金黄色葡萄球菌，为导致本地区乳房炎感染的主要细菌。大肠杆菌一般来自环境，要根除环境细菌性乳房炎是很困难的。这也提示了本地区饲养管理、环境卫生等环节存在一定问题。因此防控奶牛乳房炎，要从根本上改变管理不完善、卫生不整洁、消毒不彻底、挤奶不科学和干奶不合理等的现状。

目前，对于奶牛乳房炎的治疗国内外仍然以抗生素为主，但长期的滥用与乱用抗生素导致了大量耐药菌株的出现[12]。从试验结果可知，导致奶牛乳房炎的大肠杆菌对常用的抗生素已经产生了不同程度的耐药性，其中耐药程度最高的分别为克林霉素、万古霉素、青霉素等，长期以来牛场惯于采用的干奶期使用青霉素封闭乳头的做法，导致了没有任何一株分离得到的大肠杆菌对其高度敏感。这与国内外报道的结果基本一致[13-15]。防治奶牛乳房炎，不仅要做到科学管理从源头上杜绝微生物感染，还要合理选用抗生素。避免长期频繁使用同一种或同一类抗生素，要做到交叉用药，中西药结合治疗也有很好的效果[16]，尽量减少抗生素使用量。预防重于治疗，治疗做到科学系统有原则，才能有效控制奶牛乳房炎的发生。

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[16]龚平阳，肖兵南，戴强．中草药防治奶牛乳房炎的研究进展[J]．广东畜牧兽医科技，2009，34（2）：9-11．

（编辑：韩斌）

Bacteria isolation and identification of cow mastitis and antibiotic sensitivity testof the predom inantstrains in Shenyang area

Sun Fangfang,He Jianbin*
（Col lege of Animal Science and veterinary medicine,Shenyang Agricultural University, Liaoning Shenyang 110866）

In order to bet ter develop prevention measures of cow mastitis,6,289 mi lk samples f rom dairy cows suf fering f rom cl inical mastitis in Shenyang area were col lected and used for bacterial isolation and identi f ication.Four classes total ing 3,549 kinds of bacteria were isolated, mainly Escherichia coli,Staphylococcus aureus,St reptococcus agalactiae,and St reptococcus uberis.The antibiotic sensitivity test revealed that E.col i st rains were highly sensitive to piperacil l in,of loxacin,clindamycin,and vancomycin.

Cowmastitis;bacterial isolation and identi fication;E.col i;susceptibi lity testing

S852.61

：B

：1672-9692(2014)02-0044-04

2013-12-31

孙芳芳（1982-），女，硕士研究生，研究方向奶牛疾病防治。

何剑斌（1969-），男，博士，教授，主要研究方向奶牛疾病防治。