HPLC法同时测定苦刺花中苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱的含量

王晓萍 石会丽 李富贤 雷 琨 冯一凡 米彩峰 陕西省中医医院（西安710003）

苦刺花（Sophora viciifolia Hance）为豆科槐属植物，野生落叶灌木。由于苦刺花根、茎、叶、花、果和种子均入药，且有清热燥湿，消炎止痢，凉血解毒等功效。民间用于治疗咽喉肿痛、肺热咳嗽、湿热痢疾，痔疮肿毒，皮肤瘙痒等［1］。均含有苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱，槐定碱，槐胺碱，苦丁碱等13种生物碱［2］。现代药理研究表明其生物碱具有多方面的生物活性，抗癌、抗炎抗过敏和增加免疫力等独特的药理作用。但未见苦刺花种子中四种生物碱含量分析测定方法的相关报道。本研究以其种子为材料，采用HPLC法同时测定其碱含量，可为苦刺花种子内在质量的评价提供参考和理论依据。

1 仪器、试剂及试药 仪器：日本岛津LC-2010A型高效液相色谱仪，UV-VIS紫外-可见检测器，CLASS-VP色谱工作站，四元溶剂系统，柱温箱；ZORBAX-C18柱（250mm×4．6mm）；电子分析天平（型号：BP211D，d=0．01mg，德国塞多利斯天平有限公司），超声波清洗器（型号：KQ-100，昆山市超声仪器有限公司）。Millipore美国超纯水制备系统；FW117型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

试剂：甲醇为色谱纯；氨水、氯仿、磷酸为分析纯；水为自制超纯水；对照品氧化苦参碱（供含测用，批号110780-200405），氧化槐果碱（供含测用，批号111652-200301），苦参碱（供含测用，批号110805-200507），购于中国药品生物制品检定所。槐果碱（本实验室自制并鉴定，含量＞99．9%）。

试药：采集于陕西柳林镇的野生白刺花种子、果实、花、根、叶，并由本所冯一凡研究员鉴定为豆科槐属植物苦刺花。

2 色谱条件 色谱柱：ZORBAX-C18柱（4．6mm×250mm，5μm）色谱柱，预保护柱：Phenomenex，Security Guard，流动相为0．4mol·L-1磷酸溶液-甲醇（9：1）；流速1．0mL／min；检测波长220nm；柱温30oC；试样进样量10μL；检测时间12min。测定结果，苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱与氧化槐果碱可以完全达到基线分离。该方法能够用于白刺花及其他生物材料的氧化苦参碱等上述四种生物碱的分析测定。

检测时间15min，理论塔板数以3号色谱峰计，不低于1万。采用优化的色谱条件下，可以在15min的分析时间内实现对4个被测化合物的完全分离，混合对照品（A）和苦刺花种子样品（B）的色谱图见下图。

3 方法与结果 3．1对照品溶液的制备 分别精密称取苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱各适量，置于50mL容量瓶中，用0．4moL·mL-1磷酸-甲醇（9：1）溶解并定容至刻度，配制成混合对照品，其浓度分别为 0．113mg·mL-1、0．320mg·mL-1、0．545mg·mL-1、1．43mg·mL-1。

3．2 供试品溶液的制备 苦刺花粉碎（过40目筛），取0．2g，精密称定，加入浓氨溶液0．2mL，湿润，加入25mL氯仿，超声处理30min，过滤，残渣同上法再处理2次，各加氯仿15mL，合并滤液，蒸干，残渣用流动相洗涤溶于5mL量瓶中，溶液过0．45μm微孔滤膜，即为样品供试溶液。

3．3 线性关系的考察 标准曲线的建立，分别取适量的标准品混合储备液，再依次用流动相稀释至标准曲线所需的浓度。每个成分在上述色谱条件下测定5个不同浓度，每个浓度的标准溶液重复配置测定3次，通过峰面积与标品浓度建立标准曲线，将3次结果平均得到最终标准曲线，见表2。

表2 苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱的标准曲线

3．4 精密度试验 精密吸取同一对照品混合溶液与供试品溶液各10μL，分别在1d内，连续进样6次，计算日内精密度，苦参碱，槐果碱；氧化槐果碱和氧化苦参碱相对峰面积积分的RSD分别为1．06%，1．21%，1．26%，1．35%；供试品溶液测定各碱的RSD分别为0．640%，1．84%，0．689%，1．058%；表明仪器精密度良好。

3．5 重复性实验 取6份同一批药材约0．2g，精密称定，按3．2方法平行制备，在上述色谱条件下进行分析，分别计算白刺花种子样品中苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱的质量分数，其RSD分别为0．726%，0．808%，0．982%和1．061%。

3．6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10μL，分别在0，4，12，24，36，48h进样分析，分别测定色谱峰峰面积。苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱，峰面积的 RSD 分别为0．678%，1．012%，1．002和1．482%。表明48h内供试品溶液稳定性良好。

3．7 回收率试验 精密称取白刺花种子粉末0．1g（40目），9份，按要求分别精密加入已知浓度的不同对照品溶液适量，按3．2方法平行制备供试品。按上述色谱条件分别进样10μL进行测定（n=3），结果苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱的平均回收率分别为101．18%，101．09%，98．72%，98．47%，RSD分别为1．75%，1．22%，1．16%，1．23%。

3．8 样品分析 精密称取苦刺花不同部位粉末各0．2，按上述供试品方法制备，以10μL进样，测定色谱峰峰面积，根据标准曲线计算其质量分数，见表3。

表3 苦刺花不同部位的四种生物碱含量测定结果

4 讨 论 4．1 供试品制备方法的考察 根据四种生物碱的物理性质及有关文献资料［3-5］，提取溶剂考察了甲醇和甲醇-水（80%甲醇）；无水乙醇和乙醇-水（80%）；先石油醚处理后再甲醇提取；先氨水润湿后用氯仿提取和稀盐酸水溶液（pH3左右）提取等，发现氨水润湿后氯仿提取效果好，而且杂质干扰少。同时采用不同提取方法如（回流、冷浸、超声）和不同提取时间，通过测定比较最终确定提取条件为超声30min，提取3次，每次加溶剂25mL，苦刺花种子中的四种生物碱提取效率高。

4．2 色谱柱、波长和流速的选择 在实验中考察YMC-Pack ODS-A，Shim-Pack VP-ODS［2］，ZORBAXC18，Phenomenex GeminiC18［3-6］柱，不同波长、柱温和流速。最后选用ZORBAX-C18色谱柱，检测波长220nm，柱温30℃，流速1．0mL·min-1进行含量测定，各色谱峰之间分离效果好。

4．3 流动相的选择 为了能在尽量短的分析时间内获得指标成分的完全分离，分别用甲醇、甲醇-醋酸水、甲醇-磷酸水系统、乙腈-醋酸水、乙腈-三乙胺、三乙胺溶液、乙腈-磷酸水（磷酸0．1moL·L-1～0．5moL·L-1）体系洗脱［3-6］进行反复摸索。乙腈洗脱能力强，出峰快，分离度差；结果改用甲醇-磷酸水溶液后改善了分离度。最终确定用甲醇-0．4moL·L-1磷酸水溶液（1：9）为流动相，可使各生物碱成分达到有效分离，峰形稳定，可用于苦刺花的质量控制。

［1］ 张志英，梁固城，刘淑芬，等．陕西中药名录［M］．陕西科学技术出版社，1998：98．

［2］ 温 敏，毛晓健．白刺花化学成分及抗炎、抗过敏作用研究状况［J］．云南中医中药杂志，2006，1（27）：63-65．

［3］ 宋玉琴，魏玉辉，武新安．RP-HPLC法测定苦豆子总碱注射液中槐定碱、苦参碱和槐果碱的含量［J］．兰州大学学报（医学版），2007，4（33）：24-26．

［4］ 吴志娇，赵 红，薛 英，等．HPLC法同时测定氧化槐果碱、槐定碱、和苦参碱［J］．中国科学院研究生院学报，2011，28（3）：399-400．

［5］ 古丽娜·沙比尔，阿吉艾克拜尔·艾萨，石明辉，等．HPLC同时测定苦豆子中槐定碱，氧化槐果碱和氧化苦参碱［J］．中国中药杂志，2007，32（24）：2619-2621．

［6］ 李彤晖，马久太，李 晔，等．燥湿清热颗粒中苦参碱和氧化苦参碱含量测定方法的研究［J］．陕西中医，2013，34（7）：899-901．