肉制品中犬源性成分PCR检测方法的建立

熊 蕊，郭凤柳，刘晓慧，赵同欣，王 娜，颜 红

（保定出入境检验检疫局，河北保定071051）

肉及肉制品的掺杂和掺假现象是中国食品质量控制所面临的重要的挑战之一。许多国家已经相继制定了相关的法律法规禁止以假充真、以次充好，但是在肉及肉制品市场中，许多的不法商贩和个人在利益的驱使下用低价劣质的肉冒充高价优质的肉，尤其是以掺杂异种肉（比如用犬肉冒充羊肉，猪肉冒充牛羊肉等）的造假行为最为常见［1］。这不仅仅涉及到了营养价值、经济和食品安全等方面，更严重的是侵犯了消费者的合法权益。然而，当前所采用的依靠感官和经验的肉类形态学鉴别手段较为落后，已经远远不能满足食品质量监管部门对肉和肉制品掺杂掺假的现象进行控制与监管的需要，所以这类掺杂掺假的现象屡禁不止。因此，建立一种快速、科学、准确、高通量的鉴别方法已经十分必要。采用免疫学方法可以对不同动物的生鲜肉进行鉴别［2］，但是对于热加工处理的肉类而言，由于蛋白质成分或者其他的免疫原性物质被破坏而无法进行准确的源性成分鉴定。因此，对于熟肉中肉的种类鉴别一直是亟待解决的难题［3］。本研究根据GenBank中犬的特异性DNA引物序列，建立了PCR技术来鉴定真假犬肉制品的方法，为杜绝市场贸易中的欺骗行为提供了快捷而可靠的检验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 购自市售的犬、牛、羊、猪等动物生肉。熟犬肉、高压蒸汽处理犬肉（121℃，高压30min），均由河北检验检疫技术中心保定分中心加工。

1.1.2 主要的试剂与仪器设备 RNA酶、蛋白酶K、MgCl2、dNTPs、10×PCR缓冲液、Taq DNA 聚合酶、HphⅠ限制性内切酶、DNA Marker DL 2 000、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒等为北京天根生化科技有限公司产品；PCR扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其余试剂均为分析纯；ABI梯度PCR扩增仪、凝胶成像仪及电泳系统，Sigma台式离心机。

1.1.3 引物 根据GenBank中的犬源性特异性的DNA引物序列，合成了一对特异的犬源性引物，用高压灭菌的超纯水溶解，配制成100mol/L的储存液。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列分别为，上游：5′-TCCAGGTAAACCCTTCTT-3′；下 游：5′-TACGAGCAAGGGTTGATGC-3′。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA的提取 按说明书进行。用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取生犬肉、熟犬肉、高压犬肉和生猪肉的DNA作为模板，用生猪肉的模板DNA作为阴性对照，无菌超纯水作为空白对照。取适量模板DNA，使用核酸蛋白分析仪分别检测260nm和280nm处的吸光值OD260和OD280。当OD260/OD280比值在1.7～1.9时，适宜于PCR扩增。

1.2.2 PCR方法 PCR反应体系为50μL，各成分含量为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl23.0μL，2.5mmol/L 4×dNTPs 1.0μL，引物canisF和canisR（1μmol/L）各1.0μL，DNA 模板1.0μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，无菌超纯水12.7μL，混匀后离心，在PCR仪上开始循环。循环参数为：94℃3min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，35个循环；72℃5min；4℃结束反应。

1.2.3 PCR产物的鉴定

1.2.3.1 凝胶电泳鉴定 取扩增产物8μL，在20g/L琼脂糖凝胶中电泳，采用TAE电泳缓冲系统，9V/cm恒压电泳，DNA Marker DL 2 000作为分子质量对照。电泳后，Goldview染色，在凝胶成像仪下观察电泳结果。

1.2.3.2 HphⅠ限制性内切酶的酶切鉴定 取PCR产物进行凝胶电泳，回收其中的DNA片段，用HphⅠ限制性内切酶进行酶切，在25g/L的琼脂糖凝胶中电泳鉴定。

1.2.4 特异性和灵敏性试验

1.2.4.1 特异性试验 取已制备好的马、羊、驴、兔、牛、鸭和猪等15种动物肉的DNA各0.1μg作为模板，加入PCR反应体系中，进行扩增，同时设立阴、阳性对照，进行电泳鉴定。

1.2.4.2 灵敏性试验 将已制备的生犬肉、熟犬肉和高压蒸汽处理犬肉的DNA模板依次做10倍递增稀释，直到10-13，每个稀释度各取3μL作为DNA模板，进行PCR扩增，同时设立阴、阳性对照，进行电泳鉴定。

1.2.5 PCR扩增产物测序 将PCR扩增的产物经凝胶回收纯化试剂盒回收纯化后交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。序列校对后，在GenBank中进行Blastn比对分析验证所得片段是否为所需要片段。

1.2.6 市售肉制品掺假的检测 购置市售生犬肉20份、熟犬肉26份，提取其总DNA，使用PCR法测定其犬源性成分。

2 结果

2.1 PCR扩增犬源性成分DNA基因鉴定引物对的特异性

用所提取的生、熟犬肉的DNA做PCR特异性扩增，均能够得到213bp目的DNA条带，而牛、猪、马、羊、驴、兔、鸭等15种动物DNA则不能扩增出该目的条带。通过回收产物进行HphⅠ内切酶酶切，进一步证实了扩增的特异性。结果见图1、图2和图3。

图1 犬源性成分PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of canine meat

图2 犬源性成分PCR产物酶切鉴定Fig.2 The enzyme digestion results of PCR products of canine meat

图3 犬源性成分PCR扩增特异性Fig.3 The specificity test results of PCR for detecting canine ingredient

2.2 PCR鉴定犬源性成分的敏感性试验结果

将制备的生犬肉、熟犬肉和高压犬肉的DNA模板不同稀释度为模板的扩增结果表明，当反应体系中含犬源性成分全基因组DNA 4.56pg时，经过35个循环的扩增，电泳后可在紫外灯下见到明显的扩增目的条带（图4）。

2.3 PCR扩增产物测序结果

将所得片段回收、克隆、测序、校对后，在NCBI中经Blastn分析结果表明，犬源性成分DNA片段的核苷酸序列与GenBank中已登记的Canis lupus的基因序列的同源性均大于99%，证明所得片段均为目的片段（图5）。

图4 犬源性成分PCR扩增灵敏度试验结果Fig.4 The sensitivity test results of PCR for detecting canine ingredient

图5 犬源性核苷酸序列同源性比对Fig.5 Nucleotide sequence homology of canine ingredient

2.4 市售肉制品的犬源性成分检测

犬源性成分检测结果见表1。使用本研究建立的PCR方法对市售的犬肉进行犬源性成分的检测，其中生犬肉20份，检测出阳性样品为20份；熟犬肉26份，检测出阳性样品为26份。阳性样品检出率均为100%。

表1 市售肉制品的犬源性成分检测Table 1 The dog source detection in commercial meat

3 讨论

由于肉在热加工过程中，DNA会发生降解，它的长度在120℃左右时就会锐减到600bp以下［4］，因此，我们选择了扩增长度为213bp短小片段，以避免出现假阴性结果。通过本试验表明，利用一对犬源性引物扩增出的PCR产物，经过凝胶电泳和Marker相比较，并且经过HphⅠ内切酶酶切鉴定和序列比对后，与预期的DNA片段大小一致，用该引物可以进行生熟犬肉的基因组DNA的扩增，并且扩增的产物片段大小一致，而其他15种动物肉未获得扩增产物。用本法检测犬源性成分的灵敏度达到4.56pg DNA。建立本方法后，对市售的46份生、熟犬肉制品进行了鉴定应用，检测准确率达到100%，这说明保定市区的市售犬肉都含有犬源性成分。同时还对这46份样品做了其他动物源性成分的检测，暂未发现有掺假现象，原因可能与当地人们的饮食习惯有关，犬肉的消费市场没有那么大，即使掺假也得不到利润。

本方法着重解决了肉类，尤其是经热加工处理后的熟肉制品种类鉴定问题，由于所用的传统方法是依靠感官与经验的肉类形态学鉴别手段对肉制品掺假进行鉴定，已经不能满足当前市场需要，所以急需一种快捷、简便、特异性和敏感度高的检测手段来填补肉制品市场上对掺杂掺假现象进行监管的有效手段。本方法的建立为市场肉类的管理、刑侦提供了快速、可靠、方便的手段。由于目前相关法律法规没有明确规定，要求市场上的肉制品要标示出所含肉类的种类和含量，所以对市售的肉制品中的动物源性成分进行定量检测意义不大，故使用本试验中的引物对肉制品进行定性分析足可以满足市场检测的要求。不过，该法也为将来对肉制品中各种动物源性成分含量进行定量检测奠定了基础，实现检测的定量化［4］。本方法快捷、简便，可以在4h～6h内准确报告结果，能有效地缩短检测时间［5］。所建立的检测方法所需样品用量少并且结果准确，适合大规模的推广应用。

［1］何玮玲，张 驰，杨 静，等.食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法［J］.中国农业科学，2012，45（9）：1873-1880.

［2］张国利，郑明光，周志江，等.聚合酶链式反应（PCR）鉴定羊肉方法的建立及应用［J］.肉品卫生，1996（2）：1-3.

［3］侯东军，杨红菊，姜艳彬，等.利用PCR技术鉴定牛羊肉中搀杂猪肉的方法研究［J］.宁波农业科技，2009（3）：5-9.

［4］孙艳华，张智禹，牛晋阳，等.PCR法快速检测熟肉制品中肉类来源［J］.食品研究与开发，2010，31（5）：139-142.

［5］韩敏义，康明丽.PCR在肉类科学中的应用［J］.畜牧与饲料科学，2009，30（9）：57-60.