羊传染性脓疱病毒半套式PCR检测方法的建立及应用

邓 宇

（西昌学院动物科学学院，四川西昌615013）

羊传染性脓疱病毒又称羊口疮病毒（Orf virus，ORFV），能引起人与绵羊、山羊等多种动物共患接触性、嗜上皮性传染病。该病毒可以引起动物的口、唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱、溃疡和疣状厚痂，并伴有恶臭，羊群发病率可达90%，病死率1%～25%［1］，人通过接触患病动物或者病原污染物而感染发病，尤其是牧民、兽医、屠宰工人等，以手指等部位出现亚急性皮肤感染为主［2］，其临床症状表现为指间、手背和前臂部出现疱疹、破溃。因此，羊传染性脓疱病毒的流行严重危害羊的健康，同时也威胁到人的健康，是一种较为严重的人兽共患传染病病毒。

羊传染性脓疱的临床特征与绵羊痘、山羊痘较相似，血清学上存在交叉反应，因此采用血清学方法不容易将ORFV与绵羊痘病毒、山羊痘病毒鉴别［1-2］。目前，PCR检测方法是一种常用的鉴别诊断技术，本研究旨在建立一种能鉴别诊断羊传染性脓疱病毒与绵羊痘病毒、山羊痘病毒的半套式PCR方法，为羊传染性脓疱病毒检测提供快速、特异、敏感的有效检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品及毒株 ORF疑似病料30份，采自西昌市、会理县、德昌县、攀枝花市、汉源县等地发病山羊口唇部痂皮；羊传染性脓疱病毒XC13株，由攀西动物疫病检测与防控四川省高校重点实验室分离鉴定保存；山羊痘病毒疫苗株（GPV）、绵羊痘病毒疫苗株（SPV）、禽痘病毒疫苗株（APV），为某疫苗生物公司产品。

1.1.2 主要试剂 动物病毒DNA提取试剂盒、pGM-T载体、质粒抽提试剂盒为天根生物科技（北京）有限公司产品；2×Power Taq PCR Master Mix、多功能DNA纯化回收试剂盒为BIOTEKE生物科技有限公司产品；DNA Marker DL 2 000为上海捷瑞生物科技有限公司产品；羊传染性脓疱抗原检测ELISA试剂盒为上海恒远生物科技有限公司产品。

这里需指出的是，fmax和采用哪两个位置的粒子速度信号直接相关，fmin是较为粗略的估计，总体上看式(11)只是对有效频段的近似估计，便于工程上参考使用。

1.2 方法

1.2.3.3 PCR产物鉴定 第2轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，切胶，按多功能DNA纯化回收试剂盒说明书回收纯化PCR产物，纯化PCR产物克隆至pGM-T克隆载体，采用质粒抽提试剂盒抽提质粒，酶切鉴定为阳性克隆送上海Invitrogen公司测序。

1.2.5 半套式PCR方法敏感性试验 以ORFV XC13株DNA为模板，采用半套式PCR扩增，将PCR产物回收纯化后构建重组质粒，阳性质粒采用核酸蛋白分析测定其OD 260nm值，计算其拷贝数，将重组质粒10倍倍比稀释，以各稀释度重组质粒为模板进行半套式PCR扩增，以检测所建立的PCR方法敏感性。

网络安全包括黑客的攻击和病毒的破坏等，但是这些来自网络外部的威胁，在现有的常规安全防御理念里已经进行了严密的监控。比如在网关级别、网络边界（防火墙、漏洞扫描、防病毒、IDS）等方面的防御，将重要的安全设施集中于机房或网络入口处，设置防火墙、入侵检测系统和VPN等，这些举措使得来自网络之外的威胁大大降低了。在外网安全的威胁假设中内部网络都是安全可信的，威胁都来自于外部网络，其途径主要是内外网边界的出口［2］，所以只要将网络边界处的安全控制措施做好，就可以确保整个网络的安全。

1.2.2 DNA提取 取ORFV XC13株细胞毒株、疫苗毒株在-30℃反复冻融3次，1 200r/min离心5min，取上清备用。用生理盐水清洗临床组织病料，用灭菌剪刀剪碎后，放入组织匀浆机中充分匀浆，收集匀浆液，-30℃反复冻融2次，1 200r/min离心5min，取上清置-30℃冻存备用。取上清按动物病毒DNA提取试剂盒操作方法提取病毒DNA。

1.2.6 半套式PCR方法重复性试验 选择不同稀释度的同一DNA模板进行4次重复PCR扩增，再选取4个不同稀释度DNA模板进行4次重复PCR扩增，以验证建立的半套式PCR方法的稳定性。

1.2.3.1 第1轮PCR扩增 以抽提的 ORFV XC13株DNA为模板，建立25μL PCR反应体系：2×Power Taq PCR Master Mix 12.5μL，上游引物ORF-P1（10μmol/L）0.5μL，下游引物 ORF-P2（10μmol/L）0.5μL，DNA 2.0μL，ddH2O 9.5μL。反应程序：94℃10min；94℃50s，60℃50s，72℃1min，共36个循环；72℃10min。取PCR产物5μL在10g/L琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶成像系统中观察结果。

采用半套式PCR方法对7种不同稀释度的DNA样品进行扩增，电泳结果显示，最低能检出3.64×101copies/μL ORFV（图3）。

1.2.1 引物设计与合成 以ORFV（GenBank Accession：JX142183）F1L基因的ORF为靶序列，采用Primer Premier 6.0引物设计3条引物，上游引物 ORF-P1：CGCAAGCCCGAGATGGTAA；下游引物 ORF-P2：CGAGCCCCATGAAGGAAAA；上游引物 ORF-P3：GATGAGGACGAACGGCTGGTA，提交上海捷瑞生物工程有限公司合成，上游引物ORF-P1与下游引物ORF-P2预期扩增465bp，上游引物ORF-P3与下游引物ORF-P2预期扩增DNA片段大小为450bp。

1.2.4 半套式PCR方法特异性试验 采用动物病毒DNA提取试剂盒提取ORFV XC13株细胞培养物、山羊痘病毒疫苗株、绵羊痘病毒疫苗株、禽痘病毒疫苗株等病毒DNA，ddH2O作为PCR扩增阴性对照，应用建立的半套式PCR进行扩增。

上述方法是直接对语句进行翻译，再加上注解，可保留原始语句。但解释过程中需要的时间比较长，也可以选择意译法来进行，直接对语句的含义进行范围，以对方国家的寓意来进行，这样能够节省大量交谈时间，对事物的理解间接达成一致。例如“She was born with a sliver spoon in her mouth,she can do what she likes.”其中“She was born with a sliver spoon in her mouth”直译为她出生时嘴里含着一支银勺子，这样直译就曲解了文章原有的意思，结合英语文化，可以意译为“她出生在富贵之家”。

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1.2.3 半套式PCR方法的建立

1.2.7 半套式PCR方法临床应用 分别采用羊传染性脓疱抗原检测ELISA试剂盒与所建立的半套式PCR方法对30份临床症状疑似ORF山羊组织样品进行检测。

2 结果

2.1 半套式PCR扩增及鉴定

采用所建立的半套式PCR方法，以提取的ORFV XC13株DNA为模板进行扩增，获得大小为450bp特异性扩增片段，与预期扩增DNA片段大小一致（图1）。回收、纯化、克隆至pGM-T载体上，测序后在GenBank中BLAST分析，与ORFV毒株的同源性达98%以上。

图1 半套式PCR扩增结果Fig.1 The amplification result of semi-nested PCR

2.2 特异性试验结果

对ORFV XC13株细胞培养物、山羊痘病毒疫苗株、绵羊痘病毒疫苗株和禽痘病毒疫苗株提取的DNA、ddH2O进行半套式PCR扩增，结果表明，所建立的PCR检测方法能够从ORFV XC13株细胞培养物中特异性扩增出450bp片段，而其余样品均未扩增出450bp片段，呈阴性（图2）。

图2 半套式PCR特异性试验结果Fig.2 The specificity test of semi-nested PCR

2.3 敏感性试验结果

1.2.3.2 第2轮PCR扩增 采用50μL反应体系，取第1轮PCR产物1μL，2×Power Taq PCR Master Mix 25μL，上游引物 ORF-P3（10μmol/L）1.25μL，下游引物 ORF-P2（10μmol/L）1.25μL ddH2O 21.5μL。反应程序与第1轮PCR相同。取PCR产物50μL在10g/L琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶成像系统中观察结果。

图3 半套式PCR敏感性试验Fig.3 The sensitivity test of semi-nested PCR

2.4 重复性试验结果

对不同稀释度同一DNA模板与4个不同稀释度DNA模板样品用建立的半套式PCR方法进行4次重复扩增，结果均为阳性，表明所建立的PCR检测方法具有良好稳定性。

2.5 半套式PCR检测方法的临床应用

应用ORFV ELISA抗原检测试剂盒对采集的30份临床疑似Orf病料进行检测，结果检出9份阳性，用建立的半套式PCR方法也检出9份阳性，结果与之一致，同时还从ELISA检测呈阴性的病料中检出2份为阳性。结果表明，所建立的PCR检测方法稳定性高、敏感性强。

3 讨论

ORFV属于痘病毒科（Poxviridae）脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirinae）副痘病毒属（Parapoxvirus）成员，基因组大小为134kb～139kb。该病毒中间为约130个编码基因组成大的中心编码区，两端为反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）［3］。 其 中 嵌 合 表 达 ORFV011 蛋 白 与ORFV059蛋白可以增强该病毒DNA免疫原性［4］。ORFV保守核心区内的F1L和B2L基因，保守性很高，目前根据B2L基因序列设计引物，建立了各种PCR检测方法并得到广泛应用。Modal B等［5］根据该基因建立了半套式PCR方法，能够检出低拷贝病毒粒子。Tsai S M等［6］利用B2L高度保守区，设计合成了6条引物，建立了诊断ORFV的LAMP方法，结果表明，该LAMP检测ORFV具有快捷、准确、敏感特点。Gallina L等［7］建立了Taq Man实时定量PCR方法，用于检测感染细胞、临床样品中的ORFV，检测效率高、重复性好。李前瑞等［8］根据ORFV B2L、F1L和VIR 3个基因设计引物，建立三重PCR方法，结果该方法能特异扩增出3个基因相应片段、特异性好。

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本研究根据ORFV保守核心区另外一个保守性很高的F1L基因设计合成引物建立半套式PCR方法，在设计下游引物ORF-P2时，在该引物5′端额外添加碱基G、C，对保证扩增的特异性、敏感性起到了一定作用。经过特异性、敏感性、重复性试验，结果证实，该方法能特异性鉴别ORFV、SPV、GPV，最低检出量为3.64×101copies/μL，表明所建立的半套式PCR方法特异性好、敏感性高，能应用于临床样品检测。

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ORFV已成为危害山羊健康的主要病毒之一，不可忽视，该病毒正在威胁我国绵羊业［9］。目前暂无有效疫苗对Orf进行预防，一旦发病，为避免与SPV、GPV混淆，应及时鉴别诊断，隔离Orf发病羊，采取相应治疗措施，加强环境消毒。

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