颗粒蛋白前体与类风湿关节炎的研究进展

陈佳喜 沈 波

一、TNF的简介

TNF是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，按其存在状态分2型:mTNF和 sTNF。膜结合 TNF(membrane-bound TNF，mTNF)即Ⅱ型跨膜蛋白TNF，在金属蛋白酶水解作用下可变为可溶性TNF(soluble TNF，sTNF)。研究发现，mTNF与sTNF间存在巨大的生物学功能差异:sTNF是急慢性炎性反应过程中的促炎性因子;而mTNF在急慢性炎性反应过程中能抑制炎症的激活，已有研究报道mTNF能抑制自身免疫性脑脊髓炎、慢性关节炎等自身免疫性疾病[1，2]。

sTNF是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，按其结构分为2型:TNF-α和TNF-β。TNF中发挥主要生物学活性的是肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor-alpha，TNF-α)，主要由单核 -吞噬细胞分泌，其他如淋巴细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等在一定条件下也具有产生和释放TNF-α的能力。而肿瘤坏死因子 -β(tumor necrosisfactor-alpha，TNF-β)主要由活化的自然杀伤细胞和T淋巴细胞产生。TNF-α是一种促炎性细胞因子，主要调节细胞增殖和细胞凋亡，有细胞毒和细胞溶解作用，并与其他细胞因子一起形成复杂的免疫网络影响细胞的生长分化。

二、TNFR的简介

TNF-α通过细胞膜上的肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)发挥生物学活性，TNFR按相对分子质量分为两类，TNFR1(CD120a)和TNFR2(CD120b)。它们的胞外区都含有4个富含半胱氨酸的结构域(cysteine-rich-domain，CRD)，每个CRD由6个半胱氨酸组成，形成3对二硫键，CRD独特的结构决定TNF-α与TNFR之间的特异性结合，与TNF-α结合部位是CRD2和CRD3。TNFR1和TNFR2与各自配体结合，激活特异信号通路，参与不同的效应。一般来说，TNFR1表达很广泛，主要促进炎性反应[3]。而TNFR2主要表达在淋巴细胞上，能刺激淋巴细胞的激活，此外它还能抑制Treg细胞的激活及其免疫抑制功能[4]。

三、TNF-TNFR信号通路简介

TNFR1主要激活强烈的NF-κB信号通路从而介导胞内死亡区域有效激活caspases通路，而TNFR2与TNFR1转导的信号通路相反:TNFR2缺乏死亡区域，只能通过经典或非经典的NF-κB信号通路激活细胞保护功能，抑制坏死通路介导细胞的死亡[5]。因此，TNFR2能抑制 TNFR1介导的促炎性反应，在不同疾病动物模型中发挥神经保护、组织修复功能[6]。

TNFR2在抗原激活、增生、生存中均发挥中要作用。最近，TNFR2信号通路还被证明能选择性促进Treg细胞增生及其细胞功能的发挥[7]。mTNF致耐受性作用也被归纳为是通过TNFR2发挥。因此，免疫反应中TNFR1与TNFR2介导不同的重要信号通路提示可通过靶向抗TNF-α治疗。

四、PGRN的生物学效应

近年来研究发现，颗粒蛋白前体(progranulin，PGRN)就能与TNFR2强烈结合，在类风湿关节炎的治疗过程中起着重要的作用[8]。人PGRN蛋白由染色体17q21上 PGRN基因编码，相对分子质量为88kDa，含有7个半富含丝氨酸的串联重复序列结构域(CX5-6CX5CC X8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5-6C)，该前体被蛋白酶水解后，生成7.5个高度保守、具有生物学活性的多肽片段，称为颗粒蛋白[9]。目前，PGRN生物学效应主要归于促发育生长的作用和炎症调控作用两个方面。

1.促发育生长的作用:PGRN能够调节健康组织的生长、维持、修复。在损伤的皮肤组织中，PGRN直接作用于成纤维细胞和上皮细胞，增加中性粒细胞、巨噬细胞的聚集，促进血管内皮细胞和成纤维细胞的增生、分化和迁移，形成新生血管，加速伤口愈合。而在未损伤的组织中，成纤维细胞和内皮细胞中均检测不到 PGRN[10]。PGRN还参与肿瘤的形成和增生。遗传性PGRN缺陷会导致痴呆和胶质母细胞瘤等神经系统肿瘤，但PGRN增多也会导致肿瘤的发生，如在乳腺癌、肾细胞癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤患者外周血液中均发现PGRN的高水平表达，且可作为预测肿瘤复发、观察疗效的生物标志物[11～14]。

2.炎症调控作用:PGRN具有重要的抗炎作用，是TNF-α的潜在抑制剂。在动脉粥样硬化患者颈动脉内膜平滑肌细胞标本中存在PGRN表达，提示PGRN参与动脉粥样硬化形成这一慢性炎症过程，过表达PGRN或加入外源性重组PGRN均可减少平滑肌细胞IL-8的分泌，而PGRN基因敲除的细胞中IL-8水平明显上升[15]。PGRN在控制自身免疫性疾病如类风湿关节炎的进程中也起到关键作用。已发现局部注射重组PGRN可使多种关节炎模型小鼠体内中性粒细胞炎性反应被抑制，提示PGRN是重要的炎性抑制因子。而且PGRN在关节炎性动物模型中可与TNF受体选择性结合并抑制下游炎性通路信号，显示出良好的抗炎治疗效果[8]。最新多项临床研究发现，类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的患者血清PGRN水平明显高于正常人群，其高表达的机制可能提示机体慢性炎症、免疫紊乱状态[16～19]。

五、PGRN与TNFR2结合可抑制TNF-α的作用

鉴定PGRN与TNFR2特异性结合拮抗TNF-α信号可深入了解PGRN的作用及其作用机制，可为类风湿关节炎等由TNF-α信号介导的疾病提供更好的治疗方案。

通过全基因扫描后发现TNFR2确实是PGRN特异性受体[8]。TNF- α、PGRN 均可与 TNFR1、TNFR2结合，但 TNF-α与 TNFR1有更高的亲和力，而PGRN与TNFR2有更高的亲和力。因此PGRN可通过干扰TNF-α与TNFR受体结合拮抗TNF-α的信号通路。已报道，加入PGRN能抑制TNF-α介导的嗜中性粒细胞的激活、软骨的降解。而且去除PGRN能显著增加嗜中性粒细胞释放H2O2，及骨髓来源的巨噬细胞释放NO，加剧TNF-α介导的软骨的破坏。

六、PGRN与类风湿关节炎的研究进展

为深入了解PGRN在类风湿关节炎小鼠体内的作用，实验将小鼠体内PGRN基因敲除，发现PGRN-/-缺陷小鼠在Ⅱ型胶原诱导后能引发更严重的关节炎，表现为100%的发生率，炎症得分比PGRN基因不敲除的同种小鼠更高，骨、关节的破坏也更严重，而应用重组的PGRN后能完全逆转疾病的进展[8]。提示体内PGRN表达缺失将更容易诱发关节炎，但可运用重组的PGRN逆转。

为深入了解PGRN体内抗炎作用是否通过抑制TNF-α信号介导，发现TNF转基因小鼠去除PGRN基因后将自发关节炎、去除PGRN基因后显著加重已发的关节炎。虽然TNF转基因小鼠能自发轻度症状的类风湿关节炎，但相对TNF-Tg PGRN+/+12周龄的小鼠，TNF-Tg/PGRN-/-和TNF-Tg/PGRN+/-小鼠关节肿胀畸形严重影响活动(其滑膜炎症、血管翳形成、关节破坏、软骨基质破坏明显)。用重组的PGRN治疗TNF-Tg小鼠能消除肉眼可见的关节炎和显著降低炎症得分，而停用重组的PGRN治疗7天后又发展出肉眼可见的炎症及增加炎症得分[8]。

虽然PGRN有强烈的抗炎作用，但多种不良反应限制了它在临床的直接运用，如强致癌阻碍它的临床应用。因此研究人员设计了一种新型蛋白-拮抗TNFR受体抑制TNF/TNFR信号通路(antagonist of TNF/TNFR signaling via targeting to TNF receptors，Atsttrin)，简称为Atsttrin。这种蛋白由3个PGRN片段组成，具有选择性的TNFR结合特性，之后他们利用Atsttrin和PGRN分别进行动物实验，结果发现Atsttrin具有更强的抑制关节炎的活性。并且Atsttrin有更少的不良反应。事实已证明，运用高剂量的Atsttrin对横纹肌肉瘤细胞株A673/6几乎没有细胞毒作用，而DBA1/J小鼠每天注射高剂量的Atsttrin，对其心、肺、胃、脾、胰腺、小肠、结肠均未观察到不良反应。

PGRN与TNF都是TNFR的配体，两者存在竞争关系，它们之间的平衡能更好地解释炎症及肿瘤间的关系，例如TNF活性增加会增加RA等自身免疫性疾病的发生。反之，PGRN活性增加会增加细胞的过度增生甚至导致肿瘤的发生。现如今的TNF抑制剂大多与TNF结合，从而抑制TNF介导的炎性发生。但此治疗过程必定会增强PGRN与TNFR的结合，而增强的PGRN活性将导致细胞的过度增生，最终可导致肿瘤的发生。而Atsttrin能直接与TNFR结合，既能抑制TNF的作用，降低RA等自身免疫性疾病的发生，也能抑制PGRN的作用，降低细胞的过度增生甚至抑制肿瘤的发生[20]。

七、PGRN激活TNFR2信号通路

越来越多的研究已证实PGRN与Atsttrin通过TNFR2信号通路保护RA关节侵蚀的机制:①可通过拮抗TNF-α抑制炎性反应，已证实PGRN与TNFR2的结合能力是TNF-α的600倍，因此PGRN与TNFR2的结合后可抑制炎症的进展[20];②可通过刺激Treg细胞分化，已证实PGRN能促使原始细胞向Treg细胞分化;③可通过TNFR2信号通路调节Treg细胞功能，因为Treg细胞只能表达TNFR2，而不能表达TNFR1，因此能预防多种自身免疫性疾病，而且PGRN能保护Treg细胞免受TNF-α介导的炎性反应[7]。

八、展 望

PGRN是具有多种生物学效应的内源性蛋白，同时也是TNFR2的一种配体，可作为TNF-α信号途径的拮抗剂，从而扰乱TNF-α/TNFR1相互作用。已证明PGRN在小鼠炎症关节炎的病理发生过程中扮演了重要的角色。发明的Atsttrin作为PGRN的衍生物，不良反应更少，且能更强地抑制RA的发病及炎症进展。因为很多疾病都涉及TNF/TNFR信号通路，因此，拮抗此信号通路将能治疗多种疾病，但目前针对PGRN的信号转导机制仍不完全清楚，对其细胞信号通路的深入研究，可架起连接二者的桥梁，加深对类风湿关节炎发病机制的理解，将成为今后相关疾病的早期诊断和治疗提供科学依据。

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