LIMK与肿瘤侵袭转移的研究进展

周志刚 秦 晶 姜 浩 苏 琦

侵袭和转移是恶性肿瘤的基本特征，是导致癌症患者死亡的最重要原因之一。目前大量研究证实，LIM激酶(LIM kinase，LIMK)在多种人类肿瘤尤其高侵袭性的肿瘤中高表达。LIMK通过磷酸化和失活肌动蛋白解聚因子cofilin调节actin聚合，参与调节肿瘤血管的生成、肿瘤细胞迁移和增殖、细胞周期进展等多种肿瘤细胞生物学行为，促进肿瘤侵袭和转移。因此，LIMK可能是一个很有潜力的遏制肿瘤侵袭转移的治疗靶点。

一、LIMK的结构及生物学功能

LIMK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，LIMK家族有两个成员，即LIMK1和LIMK2。LIMK1基因位于7q11．23，含39499个碱基，包括16个外显子;LIMK2基因位于22q12．2，含68617个碱基，包括19个潜在外显子。两者在结构上都具有两个N-末端的LIM结构域、C-末端的激酶结构域与两者之间的一个PDZ结构域。LIM激酶具有50%的整体序列同源性，而激酶结构域的序列同源性高达70%，其中LIM结构域由LIM1和LIM2一对锌指结构域组成，富含半胱氨酸/组氨酸序列，是多种蛋白与蛋白之间相互作用的结构域，在调节激酶活性中起重要作用。PDZ结构域包括两个富含亮氨酸的核输出信号，可影响LIMK的核浆穿梭，使LIMK1优先定位在细胞质中，而缺失PDZ结构域的LIMK1突变体则主要定位在细胞核中。C-末端激酶部分包含一个由一段碱性氨基酸残基所构成的核定位序列［1］。

LIMK1和LIMK2均可磷酸化ADF/cofilin的第3位丝氨酸(Ser3)，使其不能切割F-actin形成G-actin而失活，从而调节肌动蛋白聚合，LIMK整合了多种调节肌动蛋白聚合的上游通路信号，对血管生成、细胞迁移、增殖、细胞周期、形态发生及癌变等多种细胞生物学功能具有重要影响。虽然LIMK1和LIMK2结构明显相似，但两者亚细胞定位不同，LIMK1主要定位于黏着斑，而LIMK2主要集中在细胞质中的斑点，这表明它们可能具有不同的细胞功能，LIMK1主要参与癌细胞中微管的拆卸及侵袭转移，LIMK2则在促进细胞周期进展中起重要作用［2，3］。

二、LIMK的调节机制

1．LIMK活性的正调节:LIMK的活性受到GTPase Rho蛋白调控。GTPase Rho蛋白家族成员包括Rho，Rac和 Cdc42，分别通过其下游效应激酶ROCK1/2、PAK1/2/4 和 MRCK α，使 LIMK 磷酸化而激活。Rho/ROCK1-2通过磷酸化LIMK1第508位苏氨酸(Thr-508)和LIMK2第505位苏氨酸(Thr-505)分别激活LIMK1和LIMK2［1］。迁移的肿瘤细胞前缘突出需要对板状伪足中的F-actin网络的精密调节，而Rac1/Pak1/LIMK1信号途径可调控层状伪足内的 ADF/cofilins活性，ADF/cofilins活性增加可加速F-actin倒转和逆行流动，使层状伪足变宽，促进迁移侵袭［4］。PAK2可诱导 LIMK和 cofilin磷酸化，沉默PAK2基因则使LIMK磷酸化明显降低。肝细胞生长因子(HGF)可通过PAK4磷酸化LIMK1导致cofilin失活，促进前列腺癌细胞迁移侵袭［5］。PKA可通过磷酸化 Ser-323和Ser-596激活LIMK1［6］。肿瘤抑制蛋白Plexin C1通过上调LIMK2诱导cofilin磷酸化和失活，抑制黑色素瘤进展［7］。

2．LIMK活性的负调节:抑制PAK调控细胞迁移的蛋白Nischarin的N-末端结构域与LIMK1的PDZ和激酶结构域的相互作用，可导致LIMK1的Thr-508磷酸化减少及其活性降低［8］。泛素连接酶Rnf6可结合并催化LIMK1多聚泛素化，导致其被蛋白酶体降解加快，半衰期从20h减少至4h［9］。研究发现，脑特异性miR-134可与LIMK1 mRNA的3'UTR结合而阻止mRNA的翻译过程，下调LIMK1蛋白表达［10］。还有报道LATS1、骨形态发生蛋白受体Ⅱ及Par-3也参与了LIMK的负性调节。

三、LIMK与肿瘤侵袭转移

肿瘤侵袭和转移是涉及到肿瘤细胞与宿主细胞和细胞间质之间的一个多步骤、多基因、多因素参与的极其复杂的过程，包括肿瘤血管生成、肿瘤迁移和增殖能力增强、细胞周期进展等多种肿瘤细胞生物学行为的改变。LIMK通过多种作用机制调节其下游蛋白在促进肿瘤侵袭和转移的过程中扮演着重要角色。

1．LIMK与肿瘤血管生成:新生血管形成是肿瘤进展、侵袭和转移多步骤过程中的一个重要环节，是一个涉及肿瘤发生、增殖及生长的多条通路的复杂动态的过程。肿瘤新生血管一般不够成熟，管壁薄弱，基膜不完整，细胞间常有裂隙，因此通透性高，是肿瘤细胞血行转移的最主要途径。研究证实，血管生成在前列腺癌的进展过程中具有重要作用［11］。LIMK1在人乳腺癌组织中高表达，并且通过上调uPA表达，诱导裸鼠移植瘤血管的生成，高表达LIMK1的人乳腺癌细胞形成的移植瘤中血管数目是对照组移植瘤的3～4倍，在肺部和肝脏出现多个微小转移灶的比率为38%，而对照组中未出现远处转移［12］。沉默LIMK1或LIMK2基因均能减少胰腺癌细胞诱导的肿瘤新生血管形成，双重敲除LIMK1和LIMK2则可完全阻遏其侵袭及微小转移灶的形成，证明LIMK1和LIMK在胰腺癌的进展与转移起着重要作用［3］。VEGF可通过激活p38/MPKAP kinase-2/LIMK1通路触发annexin 1的磷酸化，有助于内皮细胞的迁移和血管形成，而敲除LIMK1可遏制VEGF诱导内皮细胞迁移的能力［13］。LIMK可能通过多种分子机制参与肿瘤血管的生成，从而促进肿瘤细胞侵袭转移。

2．LIMK与细胞迁移:肿瘤细胞的迁移能力与其侵袭转移密切相关。研究显示，LIMK1高表达可促进对长春新碱耐药的骨肉瘤细胞的侵袭和转移，而沉默LIMK1后骨肉瘤细胞迁移能力下降［14］。LIMK1可增强细胞的迁移而促进肿瘤细胞的转移，敲除LIMK1可抑制鼠腹腔积液肝癌细胞的迁移侵袭能力［15］。抑制LIMK可通过减少细胞迁移而有效阻遏TGF-β所诱导的迁移与侵袭［16］。Nischarin可通过负调控LIMK/cofilin通路抑制LIMK活性与磷酸化cofilin而抑制的乳腺癌迁移侵袭［8］。Nischarin与丝氨酸-苏氨酸激酶LKB1可共同调节PAK-LIMK-cofilin和cyclin D1/CDK4通路，Nischarin和 LKB1缺失导致PAK1和LIMK1磷酸化水平升高，促进侵袭性乳腺癌细胞的迁移与速度和肿瘤生长与肺转移［17］。PKA可以直接磷酸化LIMK1，在细胞迁移过程中起重要作用［7］。PAK4相互作用蛋白 DGCR6L通过 PAK4/LIMK1通路可促进人胃癌细胞的迁移，沉默DGCR6L可明显抑制迁移［18］。Fascin-1在很多恶性肿瘤中高表达，其通过与LIMK1/2形成复合物调节丝状伪足的稳定性而促进肿瘤细胞迁移［19］。PKD1可介导PAK4磷酸化，形成PAK4/LIMK/PKD1复合物调节cofilin活性，导致细胞迁移［20］。LIMK1的表达与结肠癌SW480细胞的迁移侵袭能力呈正相关，二烯丙基二硫可通过下调Rac1-ROCK1/PAK1-LIMK1-ADF/cofilin通路抑制SW480细胞的迁移与侵袭［21］。抑制PKCζ能降低胶质母细胞瘤的迁移侵袭能力，其机制与损害LIMK和cofilin磷酸化有关［22］。LIMK1在乳腺癌细胞质和胞核中均有表达，并可促进MDA-MB-231细胞侵袭能力增加与裸鼠移植瘤肿瘤生长［23］。p57kip2可增强LIMK1的活性磷酸化失活cofilin，而且能促进肿瘤细胞中肌动蛋白应力纤维的形成，导致肌动蛋白动态比减少，从而影响其在细胞中的周转率，抑制肿瘤细胞迁移［24］。也有研究发现，敲除p57kip2可因LIMK1/2磷酸化水平降低而促进鼻咽癌细胞的迁移与侵袭。

3．LIMK与增殖:在恶性肿瘤细胞中促进细胞增殖的信号通路通常是激活的，LIMK1作为一种关键的细胞骨架调节剂，常参与对细胞增殖的调节。LIMK1可促进人乳腺癌细胞增殖率增加50% ～83%，并通过增加uPA在肿瘤中的表达促进裸鼠移植瘤的生长，而且肿瘤坏死区域减少［12］。敲除 LIMK1和LIMK2可导致胰腺癌细胞增殖下降［3］。然而，也有研究发现在人的结直肠癌细胞系和肿瘤中LIMK2的表达是降低的，而且LIMK2表达和活性是随着疾病进展而逐步降低，同时证实LIMK2可抑制胃肠干细胞的增殖，LIMK2缺失的小鼠癌症模型中结肠肿瘤的体积增加以及出现更严重的不典型增生和过度增生表型，LIMK2表达和底物磷酸化的减少均与患者的生存期短有关［25］。因此LIMK对细胞增殖的影响可能是多方面的，目前仍需进一步研究。

4．LIMK与细胞周期:LIMK也参与细胞周期进展，而且LIMK1和LIMK2在细胞分裂的过程中具有不同的作用。研究证实，LIMK1在前列腺肿瘤和前列腺癌细胞中高表达，在转移性前列腺癌细胞中磷酸化cofilin浓度更高，减少LIMK1可使细胞阻滞于G2/M期而抑制细胞增殖。在G1期LIMK1有助于保持细胞外信号调节激酶的活性，在有丝分裂的前中期和中期阶段LIMK1的活性和cofilin的磷酸化水平增加，在后期、末期和胞质分裂期恢复到基础水平，在有丝分裂过程中抑制LIMK1的活性，可延迟有丝分裂进程(中期到后期)。在3T3小鼠成纤维细胞中ROCK可活化LIMK2导致细胞周期蛋白A水平增加而促进G1/S期细胞周期进展。在MDA-MB-435肿瘤细胞中过度表达LIMK1也能使细胞周期明显进展［13］。

LIMK主要通过磷酸化和失活cofilin调节肌动蛋白聚合，促进肿瘤侵袭和转移。然而，最新的研究却发现LIMK1活性增加可通过影响肌动蛋白在细胞中的周转率而抑制肿瘤细胞迁移［24］。LIMK2能抑制胃肠干细胞的增殖［26］。也有报道认为LIMK2b是一种潜在的肿瘤抑制基因，LIMK2b在食管癌和甲状腺癌中下调，LIMK2b高表达使肿瘤细胞G2/M阻滞延长并抑制肿瘤细胞迁移。亦有研究证实LIMK2参与了刺激膜雄激素受体诱导前列腺癌细胞的凋亡过程。另外，LIMK还可通过形成促凋亡DAPK/LIMK/cofilin多蛋白复合物而参与TNF诱导细胞凋亡。因此，有关LIMK对肿瘤细胞生物学功能的调节作用及其机制，仍需更深入细致的研究。而且，当前对于LIMK的相关研究大多数是建立在体外实验或动物实验基础上，临床研究还不多，希望以后多开展临床方面研究，同时为开发针对LIMK的高效、特异、低毒的抑制剂找到突破点。

1 Manetti F．LIM kinases are attractive targets with many macromolecular partners and only a few small molecule regulators［J］．Med Res Rev，2012，32(5):968-998

2 Bernard O．Lim kinases，regulators of actin dynamics［J］．Int J Biochem Cell Biol，2007，39(6):1071-1076

3 Vlecken DH，Bagowski CP．LIMK1 and LIMK2 are important for metastatic behavior and tumor cell-induced angiogenesis of pancreatic cancer cells［J］．Zebrafish，2009，6(4):433-439

4 Delorme V，Machacek M，DerMardirossian C，et al．Cofilin activity downstream of Pak1 regulates cell protrusion efficiency by organizing lamellipodium and lamella actin networks［J］．Dev Cell，2007，13(5):646-662

5 Ahmed T，Shea K，Masters JRW，et al．A PAK4-LIMK1 pathway drives prostate cancer cell migration downstream of HGF［J］．Cell Signal，2008，20(7):1320-1328

6 Nadella KS，Saji M，Jacob NK，et al．Regulation of actin function by protein kinase A-mediated phosporylation of LIMK1［J］．EMBO Rep，2009，10:599-605

7 Scott GA，McClelland LA，Fricke AF，et al．Plexin C1，a receptor for semaphorin 7a，inactivates cofilin and is a potential tumor suppressor for melanoma progression［J］．J Invest Dermatol，2009，129(4):954-963

8 Ding Y，Milosavljevic T，Alahari SK．Nischarin inhibits LIM kinase to regulate cofilin phosphorylation and cell invasion［J］．Mol Cell Biol，2008，28:3742-3756

9 Tursun B，Schluter A，Peters MA，et al．The ubiquitin ligase Rnf6 regulates local LIM kinase 1 levels in axonal growth cones［J］．Genes Dev，2005，19(19):2307-2319

10 Schratt GM，Tuebing F，Nish EA，et al．A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development［J］．Nature，2006，439(7074):283-289

11 Aragon-Ching JB，Madan RA，Dahut WL．Angiogenesis inhibition in prostate cancer:current uses and future promises［J］．Oncol，2010:361836

12 Bagheri-Yarmand R，Mazumdar A，Sahin AA，et al．LIM kinase 1 increases tumor metastasis of human breast cancer cells via regulation of the urokinase-type plasminogen activator system［J］．Int J Cancer，2006，118(11):2703-2710

13 C^oté MC，Lavoie JR，Houle F，et al．Regulation of vascular endothelial growth factor-induced endothelial cell migration by LIM kinase 1-mediated phosphorylation of annexin 1［J］．J Biol Chem，2010，285(11):8013-8021

14 Zhang H，Wang Y，Xing F，et al．Overexpression of LIMK1 promotes migration ability of multidrug-resistant osteosarcoma cells［J］．Oncol Res，2011，19(10-11):501-509

15 Horita Y，Ohashi K，Mukai M，et al．Suppression of the invasive capacity of rat ascites hepatoma cells by knockdown of Slingshot or LIM kinase［J］．J Biol Chem，2008，283(10):6013-6021

16 Morin P，Wickman G，Munro J，et al．Differing contributions of LIMK and ROCK to TGFβ -induced transcription，motility and invasion［J］．Eur J Cell Biol，2011，90(1):13-25

17 Jain P，Baranwal S，Dong S，et al．Integrin-binding protein nischarin interacts with tumor suppressor liver kinase B1(LKB1)to regulate cell migration of breast epithelial cells［J］．J Biol Chem，2013，288(22):15495-15509

18 Li X，Ke Q，Li Y，et al．DGCR6L，a novel PAK4 interaction protein，regulates PAK4-mediated migration of human gastric cancer cell via LIMK1［J］．Int J Biochem Cell Biol，2010，42(1):70-79

19 Jayo A，Parsons M，Adams JC．A novel Rho-dependent pathway that drives interaction of fascin-1 with p-Lin-11/Isl-1/Mec-3 kinase(LIMK)1/2 to promote fascin-1/actin binding and filopodia stability［J］．BMC Biol，2012，10:72

20 Bastea LI，Difppler H，Pearce SE，et al．Protein kinase D-mediated phosphorylation at Ser99 regulates localization of p21-activated kinase 4［J］．Biochem J，2013，455(2):251-260

21 Zhou Y，Su J，Shi L，et al．DADS downregulates the Rac1-ROCK1/PAK1-LIMK1-ADF/cofilin signaling pathway，inhibiting cell migration and invasion［J］．Oncol Rep，2013，29(2):605-612 22 Guo H，Gu F，Li W，et al．Reduction of protein kinase C zeta inhibits migration and invasion of human glioblastoma cells［J］．J Neurochem，2009，109(1):203-213

23 McConnell BV，Koto K，Gutierrez-Hartmann A．Nuclear and cytoplasmic LIMK1 enhances human breast cancer progression［J］．Mol Cancer，2011，10:75

24 Vlachos P，Joseph B．The Cdk inhibitor p57(Kip2)controls LIM-kinase 1 activity and regulates actin cytoskeleton dynamics［J］．Gene Expr Patterns，2011，11(3-4):221-232

25 Lourenfio FC，Munro J，Brown J，et al．Reduced LIMK2 expression in colorectal cancer reflects its role in limiting stem cell proliferation［J］．Gut，2014，63(3):480-493