Notch信号与动脉粥样硬化的研究进展

付文波(综述)，丁世芳(审校)

(广州军区武汉总医院心血管内科，武汉 430070)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)斑块的形成是血管壁局部炎性级联反应发生，同其他急性或慢性感染性疾病一样，免疫反应涉及As发展的各个环节[1]。1917年美国著名遗传学家Thomas发现由于果蝇体内某些功能部分缺失，果蝇翅膀的边缘会产生缺口痕迹，将造成这种功能缺失的基因命名为Notch，并于1980年人工首次克隆成功[2]。Notch信号通路的作用遍及所有的细胞活动，在细胞的分化、凋亡、增殖等过程相关的生理和病理演变中具有精确的调节功能[3]。当前在胚胎发育过程中、肿瘤发生、神经退行性疾病、免疫系统功能调节和骨髓造血干细胞的扩增及其他各方面开展了诸多关于Notch信号通路的研究[4-6]，Notch信号通路在各种免疫细胞表面广泛表达，使人们关注Notch信号和As的相关性，但是到目前并没有得到统一的结论。

1 巨噬细胞介导Notch信号与As

巨噬细胞在As起始、发展的全过程中扮演着中心角色。巨噬细胞脂质化后形成泡沫细胞是粥样硬化发生的始动因素。巨噬细胞表面具有多种清道夫受体(scavenger receptor,SR)，如SR-BI、CD68、SR-A、SR-E及CD36等[7]。进入内膜的巨噬细胞借助表面的SR摄取经过氧化修饰的脂蛋白，在溶酶体中将其转运、消化、降解成为氨基酸和游离胆固醇，如果降解的游离胆固醇超过巨噬细胞的转运能力，那么过多的游离胆固醇将转化为胆固醇酯储存在细胞质中，脂肪负荷过重的巨噬细胞因此转化为泡沫细胞，启动As[8]，从脂质条纹、粥样斑块形成到泡沫细胞的聚集与凋亡将使粥样中心发生坏死从而触发斑块不稳定，在每一阶段巨噬细胞均发挥了关键作用。

至今巨噬细胞中Notch 信号通路调控介导As发生、发展的作用仍未得到统一结论，研究证明Notch信号家族中的Notch1受体对巨噬细胞功能调控具有重要意义。Palaga等[9]发现脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)活化的巨噬细胞中的Notch1基因和蛋白表达均明显增加，通过激活Notch1受体后检测下游目标基因Hes-1、Deltex，发现其蛋白和基因表达明显上升，而抑制Notch1则一氧化氮产生减少，炎性细胞因子诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)表达明显降低，而抑炎因子IL-10的表达是显著升高的，巨噬细胞中Notch1影响下游分子及炎性细胞因子的过程是通过髓系分化因子88依赖及非依赖的途径实现的。研究表明，激活的巨噬细胞通过介导Notch1及其下游目标基因和炎症效应因子而参与促炎反应，从而具有促进As发生的作用[10]。有研究指出，将小鼠巨噬细胞系给予干扰素γ和LPS刺激后诱导巨噬细胞活化，检测发现受体Notch1和配体Jagged1的表达明显升高，提示Notch信号可能参与了巨噬细胞的活化；在进一步研究中发现，过表达有活性的Notch1胞内段(Notch-IC)后，主要组织相容性抗原Ⅱ、细胞间黏附分子1的表达上调，同时通过活化核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路，可能参加调控巨噬细胞的抗原呈递功能，并促进肿瘤坏死因子α、IL-6和诱导型一氧化氮合酶产生[11]。但是同期也出现了相反的结论，无论是大鼠的原代肺泡巨噬细胞还是RAW264.7巨噬细胞系，Notch 1受体蛋白接受LPS激活后通过一氧化氮修饰抑制Notch1 IC与核内转录蛋白的结合，Notch1 IC转录的活性显著下降[12]。

关于不同的Notch配体及效应分子调控巨噬细胞功能的研究也不断被证实。Fung等[13]研究发现，人单核细胞白血病细胞株源巨噬细胞接受LPS诱导后Notch信号家族的DIL4配体表达显著上调，Notch受体表达变化不明显，DIL4活化后促进促炎因子诱导型一氧化氮合酶等的表达。研究表明，DIL4是活化巨噬细胞中作用最为显著的Notch配体，DIL4活化后激活NF-κB通路从而参与促炎和促动脉粥样的作用[14]。Foldi等[15]发现，Notch信号通路在调控巨噬细胞功能上与经典炎症信号通路Toll样受体家族存在功能上的串话和协同作用，研究发现巨噬细胞受到LPS激活后，Notch通路下游分子Hes-1与Hey-1的表达显著上升，而抑制Toll样受体通路后再活化Notch通路，则Hes-1与Hey-1的表达显著上升的趋势被抑制，不能最大程度上调Hey-1与Hes-1的表达，而仅单独活化Toll样受体通路，给予Notch信号抑制性干预，则不能表达下游分子Hes-1、Hey-1。Hey-1和Hes-1与巨噬细胞分泌炎性细胞因子之间存在反馈调节关系[16]。抑制Hey-1和 Hes-1表达则IL-12和IL-6蛋白分泌明显增多，Hey-1还可以在基因转录水平与IL-6启动子结合，调控其分泌。

2 T淋巴细胞介导Notch信号与As

Notch受体的家族对于淋巴细胞发育早期阶段有决定分化方向的重要作用，决定着T、B细胞命运的是向T或者B细胞定向分化[17]。Notch1在淋巴细胞的发育早期阶段有促进淋巴样前体细胞(common lymphoid precursors，CLPs)向T细胞分化，抑制其向B细胞分化的作用，在CLPs向T细胞系定向分化之后，即形成原T细胞，Notch1信号通过与T细胞受体相互作用，具有促进原T细胞向T细胞发育的作用，缺乏活化的Notch1信号诱导的CLPs则会发育为B细胞。另有研究认为[18]，Notch信号家族中配体Jagged1对于促进T细胞发育具有重要作用，胸腺上皮细胞表达的Jagged1使CLPs的胞内部位(ICN)发生裂解后激活Notch信号通路，ICN进入核内同Notch信号转录因子碱性螺旋-环-螺旋结构形成异二聚体，然后结合CSL(CSL是核内转录因子，在哺乳动物中称 CBF1，又称为 recombination binding protein-J；在果蝇中称 Suppressor of Hairless；在线虫中称Lag-1，CSL是它们首位字母的缩写，故合称为 CSL)蛋白，进一步促进决定T细胞特异性分化的基因谱系的转录，促使CLPs向T细胞发育。

有各种实验表明，T细胞参与As，T细胞免疫反应的综合结果是促进As。给予T细胞缺陷小鼠(裸鼠)高胆固醇饲料喂养,与T细胞正常的小鼠相比As的发生大为减少[19]；使用抗CD3单克隆抗体激发T细胞活化信号转导能抑制As病灶的发展[20]；将载脂蛋白E基因缺陷小鼠T细胞上CD40配基基因剔除可使粥样斑块面积减少达80%[21]。

由于Notch1活化后促进Pro-T细胞向T细胞发育，T细胞分化增加导致免疫反应的综合结果是促进As，抑制或减缓T细胞分化将延缓As，也就是说Notch1信号激活后介导的促进T细胞分化作用，可促进As发生。但是，同期Notch信号介导T细胞成员功能也有抑炎、延缓As的相关报道，Asano等[22]研究表明，在小鼠抗原呈递细胞表面过表达Notch配体Jagged1分子，能影响外周血CD4+T细胞功能，诱导幼稚性CD4+T向调节性T细胞分化，而调节性T细胞通过抑制初级与次级免疫反应使得受者小鼠获取抗原特异性耐受，产生抑炎反应从而延缓AS的发生。在小鼠的体内实验中发现，Notch配体Jagged1过表达抗原呈递细胞所活化的T细胞，Notch通路对T细胞分化为调节性T细胞有利，调节性T细胞具有免疫无反应性和免疫抑制性两大功能特征，从而产生抗原特异性耐受反应，介导抑炎反应，延缓As[23]。

3 树突细胞介导Notch信号与As

树突细胞(dendritic-like cell，DC)是具有很强的抗原摄取加工能力且能够活化初始状T细胞的唯一抗原呈递细胞，其在诱导T细胞活化、刺激初始状T淋巴细胞的增殖、介导免疫耐受等方面发挥了重要的作用[24]。体内大多数DC一般情况下处于非成熟状态，这种非成熟状态的DC也称调节性DC，研究发现调节性DC发挥抑炎作用[25]，具体机制包括：非成熟状态的DC因为缺乏各种共刺激分子而导致T细胞活化受阻或不能活化；同时由于未成熟的DC表面第二信号表达缺乏，可使抗原特异性T细胞凋亡，进而诱导抗原特异性耐受并产生抑炎反应；未成熟DC主要是分泌IL-10，其诱导2型辅助性T(Th2)反应，这对于减轻急性炎性反应有利。

多项研究证明Notch信号通路与DC的成熟密切相关。小鼠体内Notch1基因表达下降将影响DC的成熟，其机制为小鼠体内DC的成熟与NF-κB途径密切相关，DC的成熟和NF-κB活性呈协同关系，Notch1信号的低表达使NF-κB活性显著降低，从而干扰DC的成熟[26]。Wong等[27]观察了Notch信号通路的配体Jagged1在DC中差异表达介导的免疫反应，分别给予初生的小鼠注射Jagged1阳性标记的DC(Jagged1+DC)和Jagged1阴性标记的DC(Jagged1-DC)，观察小鼠T细胞增殖的差异和炎性细胞因子IL-2、肿瘤坏死因子α表达的变化：2周后小鼠淋巴结细胞在Jagged1-DC组的T细胞出现明显增殖反应，同时检测发现淋巴结细胞中的炎性细胞因子IL-2和肿瘤坏死因子α表达水平显著降低，而在Jagged1+DC组T细胞增殖反应的趋势被抑制90%。众所周知，T细胞缺少IL-2时处于免疫无能状态而不能增殖，缺少肿瘤坏死因子α使T细胞向Th2分化增加并能够抑制Th1分化，从而使炎性反应减弱。配体Jagged1在DC中差异表达提示Jagged1可诱导DC介导抑炎反应，减轻As的发生和进展。Notch信号家族成员通过介导DC的分化成熟及与炎性细胞因子调节而发挥抑炎或促炎反应，从而延缓或促进As的发生。

4 血管发生介导Notch信号与As

As是冠状动脉不稳定型斑块形成的基础，与两方面因素有关：①与斑块内大量巨噬细胞等炎性细胞的浸润有关；②与斑块肩部新生小血管数量增多有关，数量越多斑块也就越容易破裂。研究发现不稳定型心绞痛患者的斑块中，新生血管数量比稳定型心绞痛患者明显增加[28]。新生血管形成起始于内皮细胞向尖端细胞的改变，首先内皮细胞发生极性改变，然后伸出丝状伪足，其丝状伪足向前伸展因而获得迁移及侵袭能力，尖端细胞位于新生血管的最前端，因此方便接受血管内皮生长因子A、血小板源生长因子等各种生长因子信号，通过出芽、融合等方式而不断延伸、增生及扩展，同时不断募集更多周围细胞，最后形成结构完整的血管及成熟血管网[29]。此外，新生血管的结构特点也使斑块倾向于不稳定状态[30]：斑块中的新生血管管壁是由内皮细胞所形成的结构简单、管壁上细胞之间连接松散、管壁通透性高的管道，新生血管周围没有足够的结缔组织和基膜支撑，容易发生渗漏，各种胞内成分的渗漏将使斑块内炎性细胞尤其是巨噬细胞的浸润增加，而巨噬细胞的浸润增加同时促进基质金属蛋白酶的释放，降解了细胞外基质，有利于新生血管发生；巨噬细胞浸润与新生血管形成相辅相成，促进了不稳定型斑块的发生。

Notch信号通路调节血管发生对斑块的进展及稳定性起着重要的影响。Rutenberg等[31]研究表明，斑马鱼gridlock 基因与哺乳动物Notch通路中Hey-2同源，gridlock的功能缺失突变抑制动静脉分化，动脉内皮细胞缺失。Notch信号通路在尖端细胞的选择中起重要作用，配体DIL4在新生血管尖端有较高的活性，应用重组可溶性DIL4/Fc蛋白或DIL4mAb封闭DIL4分子，或应用γ分泌酶抑制剂抑制Notch胞内段形成也可以产生类似结果[32]。上述研究提示，配体DIL4能够抑制尖端细胞的形成，从而减少由尖端细胞引导的血管形成，斑块内部血管分支及内皮细胞增生减少，斑块血流灌注良好，有助于斑块的稳定性能。

各种动脉硬化危险因素，如氧化性低密度脂蛋白、高同型半胱氨酸、尼古丁等致血管内皮受损时，血管平滑肌中各种Notch通路的分子Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Hey-1和Hey-2表达水平与未受损的对照组相比，在损伤后最初2 d内表达下调，在7～14 d内上调[33]。在模拟循环血流的机械牵拉作用下，体外培养的血管平滑肌细胞中Notch1和Notch3表达明显下调，细胞增生减少，凋亡增多，过表达Notch1或Notch3能够使上述细胞的增生及凋亡水平恢复[34]。上述研究提示，Notch信号通路通过调控内皮细胞、血管平滑肌增生及凋亡对As有保护和限制作用。

5 小 结

各项研究证明，在As机制的研究中Notch信号通路的作用具有非常重要的意义。Notch信号通路通过调控各种免疫细胞参与炎性反应的生理和病理过程，与动脉硬化的病因和机制有着千丝万缕的联系，目前各种研究结果还缺乏统一定论，Notch信号家族的各个配体与受体成员具体结合机制、Notch信号转导与不同信号通路之间的协同作用、不同的配体与受体在信号转导中发挥的具体调控作用尚未阐明，亟须进一步探索存在的科学问题。

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