哮喘的遗传学研究进展

孙金霞(综述)，崔玉宝(审校)

(盐城卫生职业技术学院医学检验教研室，江苏 盐城 224005)

哮喘是一种严重的过敏性疾病，是最常见慢性病之一。它的特点是气管支气管对多重刺激的反应性增加，各种炎性细胞特别是嗜酸性粒细胞浸润增加，呼吸道上皮细胞损伤、呼吸道平滑肌肥厚，且血清总IgE升高。哮喘往往在夜间加剧，可进展为严重的气流阻塞、呼吸急促、呼吸困难和吸氧不足。在少数情况下，会引发如缺氧癫痫发作，呼吸衰竭，甚至死亡等严重后果。流行病学研究表明，全世界范围内呼吸道过敏的患病率高达15%～30%[1]，哮喘影响了3.5%～20%的人群[2]。目前全球有300万哮喘患者，且患者数以每10年50%的速度增长，据世界卫生组织估计到2020年，哮喘伴随慢性阻塞性肺疾病将成为人类第三大死亡原因[3]。哮喘的发病既有遗传因素，也有环境风险因素的作用。目前已经发现人类多个染色体上存在与哮喘相关的易患基因，对这些易患基因的确定有助于哮喘的防治。

1 哮喘遗传学研究方法

对遗传病遗传基础的研究主要依赖于两种方法：全基因组连锁分析和候选基因关联研究。全基因组连锁分析的对象是有受累遗传病患者的家族。按染色体上均匀分布的遗传标记对家庭成员进行基因分型。当遗传病患者等位基因数目高于预期值时，就要对这些遗传区域进行分析。一旦发现这样的区域，往往涉及DNA的2～3 Mbp，包含数百个基因，表明这个基因组区域内有疾病易患等位基因，即认为该区域与遗传病间具有连锁关系。该区域在后期进一步进行遗传变异位点的深度扫描，直至疾病相关基因确定为止。

连锁分析研究法能够发现新基因和新途径，不需要任何先验假设，且分辨率很高。此外，连锁分析是识别有明显表型效应的等位基因的理想方法，因为这样的等位基因在较小的人群样本中也能发现连锁信号，往往多数研究很难得到大量的人群样本[4]。通过在不同群体中发现连锁作用能进一步验证连锁分析的结果。但通常不同人群中发现的哮喘连锁区域具有区域依赖性。随着全基因组关联研究的出现和应用，全基因组连锁分析的应用在迅速衰退。候选基因关联研究重点放在一些预计对疾病的发病机制有关联一些基因。候选基因的变异及相关表型的关联分析，通过对病例-对照研究进行等位基因或基因型频率的比较来完成。一般认为，联分析在检测中等频率的等位基因时比连锁分析法更有优势。关联分析的另一个优点是，更容易收集大量没有相关性的患者样本，有助于增加数据的统计力。然而，在一个标记周围区域是完全相同的遗传特性的可能性要比家族性患者的可能小得多。因此，关联分析比连锁分析需要更高密度的遗传标记。

病例-对照研究的一个主要问题是不同人群结构会导致与疾病无关的病例与对照组间等位基因频率的差异。新统计方法的发展允许检测和校正病例和对照组间的不平衡，基于家庭的连锁分析在数据量上没有优势，而关联分析具有逻辑优势[4]。尽管如此，不管使用什么方法来推定疾病易患基因，这种基因具体的作用只能通过进一步的功能实验，如对细胞采用化学或药理学抑制剂后对功能进行分析，甚至用动物模型在体内或体外对基因功能进行验证。

2 已发现的哮喘易患基因

目前已知的对哮喘或过敏性疾病有作用的易患基因，主要通过分析过敏性炎症、哮喘或哮喘表型的主要通路上一些基因的变异，如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)间的相关性来确定。与哮喘相关的表型通常包括呼吸性状，如哮鸣音、支气管高反应性、肺功能参数；免疫学特性，如总异性血清IgE水平，过敏；临床性状，如特应性皮炎和(或)湿疹及结膜炎。

讨论哮喘及过敏性疾病的文章有很多，这里仅讨论从功能和免疫学角度来看的一些较强的哮喘和过敏性疾病易患基因。哮喘易患基因可以分为四大类：固有免疫和免疫调节相关基因；2类辅助性T细胞(T-helper type 2 cell,Th2)分化与功能效应相关基因；上皮细胞及黏膜免疫相关基因；与肺功能、呼吸道重构功能相关的基因。另外，还有一些基因是通过定位克隆确定的。下面从这几个方面进行阐述。

2.1固有免疫和免疫调节相关基因 第一组基因位于固有免疫检测和免疫调节连接处，并参与触发免疫反应。过敏性炎症和IgE调节会在很大程度上受一些编码模式识别受体和胞外受体基因的多态调节，如CD14，Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)2、TLR 4、TLR6和TLR10；胞内受体，如核苷酸结合的寡聚化结构域成分1、2。有趣的是，识别受体基因的变异不仅与哮喘等过敏症相关，还与肠炎和心血管疾病[5-6]相关，凸显了固有免疫在调节组织与微环境接口中发挥的重要作用。免疫调节细胞因子的变异，如白细胞介素(interlenkin,IL)10、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)，以及能介导IL-6的抑制作用树突细胞的信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，也会影响过敏症的易患性。固有免疫基因与不同人群哮喘性状相关，表明不同环境会对不同外环境中固有免疫系统表面产生作用。人类白细胞抗原Ⅱ类分子(human leukocyte antigen Ⅱ，HLAⅡ)在抗原呈递作用中发挥至关重要的作用，许多研究显示HLA-DR，HLA-DQ和HLA-DP等位基因，与过敏原特异性IgE反应之间存在强关联性[7]。

2.2Th2分化和效应子功能相关基因 第二组哮喘易患基因包括调节初始CD4+Th分化成Th2极化的效应表型的相关基因，而初始CD4+Th分化成Th2极化过程是过敏性炎症和哮喘的一个关键过程。Th2完全极化需要通过GATA结合蛋白3(GATA-binding protein 3，GATA3)诱导IL-4-IL-4Rα转导的信号传输及STAT6的介导。GATA3的活化是Th2的总开关，会被转录因子T-bet抑制，通过蛋白质-蛋白质相互作用，从而干扰GATA3与靶DNA结合。因此，GATA3、T盒转录因子21、IL-4、IL-4RA、STAT6及IL-12B的常见突变与哮喘等过敏性疾病以及与糖皮质激素疗的反应相关。

IL-13是过敏性炎症的中央效应细胞因子。IL-13介导动物模型在肺部由Th2介导的全部反应特征主要包括：呼吸道高反应性、炎性细胞浸润、黏液分泌过多和呼吸道纤维化。此外，IL-13、IL-4是诱导人类IgE合成的独有的两个细胞因子。IL-13及其受体在哮喘和过敏性鼻炎等呼吸道症状的患者体内高表达[8-9]，IL-13在胚胎时期即表达，在新生儿时期即在T细胞作用下分泌，而这个时期是过敏性疾病易患性的关键时期。IL-13+2044GA(IL-13 Arg130Gln，rs20541)位于编码区(Arg130Gln)，变异后的表达蛋白生物活性增加[10]，该多态性与哮喘、遗传过敏性和异位性皮炎患者的血清总IgE的增加相关。IL-13-1112CT(rs1800925)是启动子SNP，该多态与哮喘、特应性皮炎等过敏性疾病的易患风险增加相关，导致在极化的Th2中IL-13转录增加，丝裂原刺激的单核细胞中IL-13分泌增强[11]。值得注意的是，IL-13+2044GA和IL-13-1112CT高度连锁不平衡。因此，携带两个风险等位基因的个体预期会表达更多的高活性的IL-13异构体。

Th2的信号转导通路的多态性不仅影响T细胞依赖性的IgE合成，也影响了依赖于嗜碱性粒细胞和肥大细胞的Th2因子表达IgE的扩增。高亲和力IgE受体(FcεR1)的交联是肥大细胞和嗜碱性粒细胞分泌Th2因子的主要刺激因素。正因为如此，多个研究对跨膜4域，亚家族A，成员2(MS4A2)-编码FcεR1-链区域的SNP进行研究，都发现了哮喘易患位点[12]，这些区域可能影响肥大细胞的IgE依赖性炎性介质的释放。过敏性炎性反应的效应阶段依赖于嗜酸性粒细胞祖细胞中Th2来源的IL-5和IL-5RA之间的相互作用。IL-5驱动嗜酸性粒细胞招募呼吸道上皮细胞来源的趋化因子，进而成为Th2因子的一个重要来源。IL-5和IL-5RA上的SNP同样也与哮喘性状相关[13-14]，但作用不如Th2途径中其他基因的多态性作用强烈。

2.3上皮细胞相关基因 第三组易患基因在上皮细胞中表达，存在于固有免疫和适应性免疫中间层。上皮细胞分泌趋化因子，如趋化因子CCL5(CC chemokine 5，CCL5)招募T细胞和嗜酸性粒细胞，趋化因子CCL11、CCL24和CCL26则是强大的嗜酸性粒细胞的诱饵。上皮细胞也分泌抗菌肽和子宫珠/克拉拉细胞16×103蛋白，通过作用于树突状细胞抑制Th2的分化。所有这些基因是稳定的哮喘和遗传过敏性的候选基因。丝氨酸肽酶抑制因子Kazal型5(serine peptidase inhibitor Kazal type 5，SPINK5)的表达仅限于上皮细胞，保护细胞免受肥大细胞或过敏原释放的蛋白酶的蛋白酶降解作用。在SPINK5的突变会导致瑟顿综合征，表现为湿疹样的上皮细胞的功能缺陷。此外，rs2303067(SPINK5 Glu420Lys)与哮喘和湿疹有强烈相关性[15]。

聚角蛋白微丝蛋白基因(filaggrin，FLG)是一种对上皮屏障的完整性至关重要的基因，是染色体1q21上表皮分化复合物的一员。FLG在表皮和口腔及鼻腔黏膜细胞中表达，但不在支气管黏膜表达。在无过敏性皮炎的哮喘患者人群中，未发现哮喘和FLG突变的相关性。综合研究表明，特应性皮炎患者在表皮屏障破裂后才导致哮喘的发生。最近的一项Meta分析发现，FLG变异对特应性皮炎的风险超过目前研究的任何其他候选基因[16]。然而，突变诱发特应性皮炎是极为罕见的。FLG基因突变往往导致寻常型鱼鳞病，这是一种常见的隐性孟德尔遗传性疾病，皮肤呈角质化，鱼鳞病的患者高发特应性皮炎，FLG基因往往缺失或为杂合子[17]。所有这些研究结果表明，完整的上皮屏障系统在保护细胞免受环境因素的损害和复杂性基因疾病的发生中发挥十分重要的作用。

2.4肺功能相关基因 这一组易患基因主要由肺功能、呼吸道重构、疾病严重程度相关的一组基因组成，如肾上腺素受体2、肿瘤坏死因子是最为有力的哮喘易患基因。其他基因包括TGF-β1、白细胞三烯C4、肌钙蛋白C等，这些基因影响了患者的治疗，药物基因组学对这些基因进行系统研究目的是确定药理反应模式的基因变异[18]。

2.5通过定位克隆确定的相关基因 另外一类是通过连锁分析确定后，再对该基因进行定位克隆确定的哮喘易患基因。第一个定位克隆获得的哮喘基因是整合素金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33，ADAM33)[18]。①ADAM33基因，位于20号染色体的短臂末端。通过来自美国和英国的460例高加索患者的家庭进行连锁分析，确定ADAM33是哮喘易患基因，其与哮喘和支气管高反应性之间的有显著联系。ADAM33与哮喘及肺功能间的相关性在不同种族的多个人群中得到验证[19]。②植物同源结构域指蛋白11(plant homeodomain finger protein 11，PHF11)位于染色体13q14区域，与过敏和血清总IgE水平同步连锁。PHF11基因的SNP图谱上确定有与IgE水平相关的数量性状基因座。这些变异与临床重哮喘相关。③二肽基肽酶10(dipeptidyl-peptidase 10，DPP10)位于第2号染色体上，对其周围区域及高密度SNP及连锁不平衡分析表明，哮喘的相关性位点在DPP10基因的起始外显子上，DPP10基因编码二肽基肽酶的同源物，参与细胞因子和炎症趋化因子的外端的酶切作用[20]。④G蛋白偶联受体基因位于第7号染色体短臂。对健康和哮喘患者进行支气管活检，编码G蛋白偶联受体的蛋白异构体表现出明显的分布差异。芬兰、加拿大的三组人群研究发现，标签SNP单倍型与高血清IgE水平或哮喘相关[21]。⑤HLA-G，HLA-Ib基因位于染色体6p21区域，于2005年通过连锁分析确定。该基因主要表在胚胎细胞的母胎界面表达，而母胎界面参与免疫抑制，对胎儿的母源耐受细胞有关。两例哮喘患者支气管上皮细胞中检测到的可溶性HLA-G的表达，但正常个体中不表达，表明哮喘肺细胞中该基因表达上调[22]。⑥脆性X智力迟钝蛋白作用蛋白2(cytoplasmic fragile X mental retardation protein interacting protein 2，CYFIP2)位于染色体5q33区域，突变筛查和关联性分析显示，CYFIP2的6个多态性位点与哮喘的发生、发展相关，疾病相关的纯合子单倍型个体中CYFIP2表达明显增加[23]。⑦IL-1受体相关激酶-M(IL-1 receptor-associated kinase M，IRAKM)是TLR和IL-1R信号通路中的负调控因子，位于12q13～24，肺活检的免疫组织化学结果显示上皮细胞中IRAKM高表达，表明固有免疫系统的过度活化与慢性呼吸道炎症之间存在某种联系[24]。⑧3q21区域的异位性皮炎易患区域[25]，该区域仅有一个基因，即编码表皮胶原蛋白的基因COL29A1，这种蛋白在皮肤、肺和胃肠道高表达，这些部位往往与过敏性炎症息息相关。

3 结 语

虽然目前对于哮喘的遗传学机制已有大量研究，但哮喘遗传学仍然存在很多问题。在《自然遗传学》杂志的一篇报道表示，关联研究的结果很难重复[26]。同样，《胸腔》一篇评论文章认为多基因病的遗传关联研究由于设计粗糙和结果不可重复性获得广泛差评[27]。此外，即使对哮喘有影响的并且可重复的一些基因，在大量样本研究时与哮喘仅有微小相关性，只能解释极少的表型变异。为什么会出现如此大的争议和复杂性？目前普遍认为是由实验设计、样本量不同加上分析缺陷导致的。然而，存在于复杂疾病下的生物学因素和过程的作用不应忽视，如复杂性疾病的表型异质性，基因与环境间的相互作用，基因之间的相互作用都是复杂性的来源。

哮喘是环境和遗传因素共同参与的一种复杂的多基因疾病，在全世界范围内造成了巨大的经济和社会负担。现研究发现超过100个位点与哮喘有关，面对大量的易患基因信息，接下来需要做的是通过大量的基因组数据开发哮喘更优的研究手段，来进行图谱定位确定特定的基因以及表型特异的SNP位点，来澄清哮喘的发病机制，从而利用药物基因组开发个体化治疗药物。因此，不同学科人员间，包括病理生理学、流行病学，临床一线和遗传学的相关研究人员应该保持更多的交流互动，从而将哮喘相关研究不断推进。相信随着基因技术的不断更新及对哮喘相关基因研究的不断深入，哮喘患者的基因治疗即将成为现实。

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