Cdk5/p35在癫痫发病机制中的作用

张新颖(综述)，娄 燕※，董长征(审校)

(河北省人民医院 1儿科， 2神经外科，石家庄 050051)

癫痫是由脑部神经元异常高度同步化放电所致的突然性、反复性和短暂性的脑功能障碍综合征，临床表现为运动、感觉、意识、精神等多方面的功能障碍[1]，可以导致智力水平下降，学习记忆能力不足等[2-3]，严重影响患者的身心健康及正常生活质量。其发病机制复杂，治疗较为困难。国内外研究者已经从突触可塑性、二次打击及遗传学等方面对癫痫进行了广泛深入的研究，对其复杂的发病机制有了一定认识，但尚未取得突破性进展。海马苔藓纤维出芽(mossy fiber sprouting,MFS)是人类颞叶癫痫及各类癫痫模型中普遍存在的病理现象[4-6]，与癫痫的发生发展密切相关，因而MFS机制也成为癫痫研究的热点之一[7-8]。研究者最近发现细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)与其调节蛋白p35、p25等能够通过参与海马MFS，从而促进癫痫的发生[9]，引起了科学家们的普遍关注。

1 Cdk5的发现

真核细胞的细胞分裂周期(cell division cycle,Cdc)受磷酸化/脱磷酸化事件调控，参与调控的分子成员由Cdc2同源催化亚单位和属于细胞周期蛋白家族成员的调节亚单位组成。由于这些激酶需要与细胞周期蛋白结合才具有激酶活性，因此称为细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,Cdks)。Cdk5从1992年开始被多个实验室先后发现，并被予以不同的命名。Hellmich等[10]从大鼠脑组织cDNA文库中克隆出一种细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶，称为神经元Cdc2样蛋白激酶，其氨基酸序列与小鼠Cdk1同源性为58%，与人类Cdk2同源性为61%。同一时期，Meyerson等[11]在寻找真核细胞周期中可能起重要作用的Cdks时，以对应于Cdc2保守序列的简并引物进行海拉细胞mRNA的荧光定量逆转录-聚合酶链反应，发现了Cdk5蛋白激酶。同一年，Lew等[12]在牛的脑组织中发现了结构上与Cdc2相似的分子，称之为脑脯氨酸-限定性蛋白激酶。而Ishiguro等[13]所发现的与微管相关的Tau蛋白激酶Ⅱ亦为同一物质。最终在1993年，Kobayashi等[14]将这个相对分子质量为30×103有活性的蛋白激酶亚单位命名为Cdk5。

2 Cdk5激酶

Cdk5基因被映射到第7号染色体上。在7q36，它是一个包含12个外显子的3.95 kb(对应于987 bp Cdk5转录物)的长DNA。Cdk5蛋白是一个相对分子质量为33×103的分子，只有与激活剂结合后才具有激酶活性。活化的Cdk5能磷酸化毗邻脯氨酸残基上游的丝氨酸/苏氨酸。

Cdk5是Cdks家族成员，在结构上与其他成员相似。像真核生物中的大多数蛋白激酶一样，Cdk5也具有与调节相关的催化域。这个催化域有一个由β-折叠构成的N端区域和α-螺旋组成的C区，两者之间有ATP结合位点。α-螺旋结构被称作Cdc2相关激酶结构，起源于多肽序列。延续的20个氨基酸残基中心位于N和C区之间，形成一个能够进行磷酸转移的构象，称为活化环。尽管结构很相似，但Cdk5的活化方式却与其他Cdks不尽相同。

Cdk5在多种神经元功能中扮演着重要角色，包括神经元迁移分化、存活及突触的发生、信息传递、可塑性[15-16]等，并可能通过下游底物的磷酸化发挥作用。

3 Cdk5激活剂

3.1p35/p39 p35是Cdk5的调节亚基，Cdk5只有与其活性调节亚基结合，才能表现出催化活性。经鉴定p39(神经元Cdk5激活剂亚型)与p35有57%的同源序列。突变研究显示，虽然p39能掩饰p35缺乏，但只能代偿p35的部分功能，而并非全部[17]。p35/p39复合物突变大鼠与Cdk5缺陷大鼠表现型基本相同，暗示在发育过程中，两种调节因子对Cdk5的影响是不能被其他分子代替的。Cdk5的这两个非细胞周期调节蛋白与激活其他Cdks的经典细胞周期调节蛋白不存在序列相似性，但三维结构却与其基序相似。p35/p39主要定位于细胞膜。Cdk5通常与其激活剂和底物区域化。但是，Fu等[18]的一个研究显示p35通过核转运蛋白β、核转运蛋白5和核转运蛋白7动态定位于细胞核和细胞质之间，并可以与它们直接交换进入细胞核。

3.2p25 p25，一个相对分子质量为25×103的蛋白，是p35被中性钙蛋白裂解后产生的C端片段。p35寿命较短(半衰期<30 min)，而p25与p35不同，它不容易降解，半衰期是p35的2～3倍。而且，p25也可以与Cdk5结合并使其激活，改变它的细胞定位和底物特异性。因此，裂解片段p25能够维持Cdk5的过度激活状态，而这种过度激活状态通常与神经毒性相关。与p35相似，在细胞内也检测到了p39的一个裂解片段p29，亦可导致Cdk5失调[19]。

4 Cdk5激酶活性调节

4.1Cdk5激活机制 Cdk5是脯氨酸限定性Ser/Thr蛋白激酶，主要在神经元中发挥作用，通过与调节亚单位p35，p25(p35的一个C端片段)或p39结合激活。在可再生细胞，大多数Cdks是在促进细胞周期进程中发挥作用的，而Cdk5活性却主要在有丝分裂后神经元被检测到。这是因为虽然Cdk5本身在许多细胞和组织广泛表达，但Cdk5活化亚单位p35和p39却主要在分化神经元表达。Cdk5与其他Cdks的氨基酸序列相似性可高达50%～60%，而且在结构上与Cdk2相似[20]。尽管p35和p39的氨基酸序列与细胞周期蛋白类不尽相同，却能激活Cdk5，这主要是因为Cdk5结合p35结构域与Cdk2结合细胞周期蛋白A的空间结构是相似的[19]。p35和p25与细胞周期蛋白在结构和序列方面的差别促成了Cdk5-p35的独特激活机制。特别是，磷酸化激活和细胞膜相关性是Cdk5的独特性质。

4.2Cdk5活性被p35合成和降解调节 脑组织中Cdk5的量要远远多于p35，这个研究结果表明Cdk5激酶活性主要是由神经元中可利用的p35蛋白量决定的[21]。而p35蛋白量是由合成和降解之间的平衡控制的。用培养的神经元和成神经瘤细胞(他们可在体外分化成神经元样细胞)研究p35的合成。在培养的皮层神经元，脑源性神经营养因子能够刺激p35表达[22]。在PC12细胞，神经生长因子能够强烈诱导p35表达，Cdk5激酶活性也随之大大增强。神经生长因子主要通过细胞外信号调节激酶途径诱导p35合成。相关研究报道在皮层发育过程中p35是转录因子热激蛋白2的靶点[23]。在细胞外基质蛋白作用下，p35的合成也增强，但是相对缓慢。当小脑神经元在层黏连蛋白存在条件下培养时，p35蛋白水平增加，导致Cdk5活性增加。在维甲酸存在时人骨髓神经母细胞瘤细胞株细胞分化，层黏连蛋白诱导p35的mRNA和蛋白高水平表达，随后Cdk5活性增加。总之，p35的合成能够被细胞外信号包括营养因子和基质蛋白等诱导，从而导致Cdk5激活。

4.3Cdk5通过蛋白酶体降解p35失活 p35是短效蛋白，半衰期<30 min。在C33A细胞、Cos7细胞和神经元均检测到了p35的泛素化。p35中不包含与细胞周期蛋白B和A(后期促进复合物/周期小体)破坏作用框相应的氨基酸序列。更确切地说，p35的分解可被冈田软海绵酸(一种蛋白磷酸酶1和2A抑制剂)刺激，被Cdk5在Thr138位点的磷酸化触发。而与p35相似的细胞周期蛋白D和E，是被泛素连接酶家族的一个成员SCF复合物(SKP1-CUL1-F-box蛋白)诱导磷酸化后降解。在皮质神经元谷氨酸盐能够导致p35降解。谷氨酸盐处理可短暂激活Cdk5-p35并磷酸化p35，导致其泛素化后降解。与之相反，p35的稳定性被蛋白激酶Cδ在Ser59、Ser65或Ser124位点的磷酸化调节。磷酸化可抑制p35的泛素化，从而抑制了其降解。在脑发育神经元迁移过程中观察到了这种作用。因此，p35降解是神经元活性的一个重要调节机制。

5 Cdk5/p35在癫痫相关病理改变中的作用

5.1Cdk5/p35在中枢神经系统中的作用 虽然Cdk5在哺乳动物组织和细胞中广泛表达，但是由于其主要的调节蛋白p35主要在中枢神经系统中表达，所以Cdk5相关的蛋白激酶活性也局限在脑内。Cdk5/p35具有十分广泛的生理作用，可以通过对tau蛋白磷酸化的调控来限定神经元极性，参与神经元迁移过程，在神经系统发育和再生中发挥作用，还能磷酸化多种含有赖氨酸-丝氨酸-脯氨酸重复序列的细胞骨架蛋白，包括神经纤维、微管相关蛋白tau及有丝分裂原激活蛋白等，参与神经元骨架中微管的装配，以提高微管的稳定性，在神经元可塑性中起着重要作用[15]。

5.2Cdk5/p35在癫痫发作中发挥重要作用

5.2.1MFS在癫痫发生发展中的作用 癫痫发作可以导致神经元轴突出芽及内分子层失神经传入，伴随的MFS能够阻断其与靶细胞之间的联系，促使这种异常出芽回返至上颗粒层，并与该层中间神经元树突和密集的颗粒细胞形成新的突触联系[24]。新建立的突触联系改变了内分子层及门区的局部环路，形成异常兴奋灶，使发作敏感性增加，诱导癫痫再次发作，这种恶性循环致使癫痫反复复发，成为难治性癫痫。有学者研究显示，MFS的变化趋势与戊四氮点燃效应的逐步建立相一致，且在大鼠癫痫发作前海马MFS已经出现[25]，说明MFS并非仅是癫痫发生的结果，MFS所反映的突触重建在促进癫痫发生和反复发作中起着重要作用。

一般认为海马CA3区神经元死亡可以诱发MFS，但过多的神经元丢失也会使出芽的苔藓纤维缺乏靶向，不利于在该区域进行突触重建，而主要投射向齿状回内分子层。在戊四氮点燃过程中，SD大鼠很少出现癫痫持续状态，海马CA3区只有少量神经元受到损伤，尚有足够数量健存的锥体细胞，能够为异位投射的苔藓纤维提供顶树突，建立新的突触联系。因此，除神经元死亡能够诱发MFS外，还可能存在其他的出芽机制。

5.2.2Cdk5/p35通过参与MFS促进癫痫发生 田发发等[26]研究发现，在戊四氮点燃大鼠模型，海马CA3区MFS的变化趋势与Cdk5及其调节亚基p35的mRNA及蛋白表达水平相一致，提示海马Cdk5/p35可能通过参与苔藓纤维出芽，从而促进癫痫的发生。

Cdk5是脯氨酸限定性Ser/Thr蛋白激酶，参与神经元迁移分化、突触的生长及信息传递等，是许多细胞骨架蛋白成分的主要磷酸化酶。Cdk5主要通过与调节亚单位p35或p39结合而被激活，p35主要分布于中枢神经系统梨状皮质、海马(CA1、CA3、齿状回)、杏仁核和内嗅皮质的分化神经元中(尤以海马内浓度最高)，是Cdk5主要的调节亚基，又被称为神经元Cdk5激活剂。实验表明，Cdk5与其调节蛋白p35在癫痫的发生、发展过程中起着非常重要的作用[25]。Cdk5/p35共同参与了神经元骨架蛋白-tau蛋白的磷酸化过程，导致其磷酸化水平的变化，进而诱发海马MFS和突触重建[27]，从而在癫痫的反复发作中起重要作用。

Tomizawa等[28]制备电惊厥大鼠癫痫模型，并在点燃过程中观察Cdk5蛋白激酶活性及其调节亚基p35表达的变化，发现Cdk5激酶活性随着癫痫发作级别的增加先升后降，p35的表达变化趋势与Cdk5激酶活性的变化相一致；外科手术切除的颞叶癫痫海马硬化标本中Cdk5活性也有显著升高[29]，提示Cdk5/p35的确参与了癫痫的发生。与此同时，在电点燃过程中，非磷酸化tau蛋白呈逐渐下降趋势，至5级发作时最低，而磷酸化tau蛋白在各级癫痫发作中均有显著的增高，以3级发作时升高最显著。Johanna等[30]在剧烈和长期发作的症状性癫痫患者脑脊液中检测到总tau(T-tau)和磷酸化tau(P-tau)水平升高。T-tau和P-tau在戊四氮点燃进程中均增加，并且T-tau和P-tau的亚细胞定位与Cdk5/p35显示相同的变化规律[25]。由此可见，Cdk5/p35可能是通过参与tau蛋白过度磷酸化来影响海马MFS和突触重建，进一步促进癫痫的发生和发展。另外，Cdk5还可以通过突触后致密物(PSD-95)、蛋白磷酸酶抑制剂1等的磷酸化来参与海马的MFS过程。

Cdk5和p35的mRNA和蛋白在大鼠海马广泛表达，主要分布于CA3区和CA1区的锥体细胞、门区神经元和齿状回颗粒细胞，在CA3区MFS过程中Cdk5的mRNA和蛋白表达，2周内主要聚集在胞质，4～6周主要在胞膜和突起。MFS形成早期，胞质内表达的Cdk5，在胞质运输中起一定作用，而在MFS高峰期，胞膜和突起中表达的Cdk5，主要对突轴运输起作用，由此可推测Cdk5促进MFS过程可能与其在细胞内的分布变化亦有一定关系。

6 结 语

Cdk5作为Cdks家族的一个特殊成员，不参与细胞周期调控，而是通过与其调节亚单位p35结合，在癫痫发作中发挥重要作用。其机制可能是：Cdk5/p35复合物形成调节Cdk5活性，通过使tau蛋白过度磷酸化来诱发海马MFS和突触重建，形成异常兴奋性环路，从而促进癫痫的发生和发展。这些研究成果显示，进一步深入研究Cdk5/p35的结构和功能，及其在癫痫发病机制中的作用，不仅对认识癫痫患者的MFS病理改变机制具有重要的意义，同时还将为临床防治癫痫提供一些新的思路。

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