Na+,K+-ATP酶信号转导功能的研究进展

马立峰，孟 海(综述)，郭 艾(审校)

(首都医科大学附属北京友谊医院骨科，北京 100050)

Na+,K+-ATP酶即钠泵，是一种广泛存在于高等生物真核细胞膜上的膜结合蛋白。它利用水解1个分子ATP释放的能量将3个钠离子泵出细胞外，同时将2个钾离子泵入细胞内。在正常生理过程中，它在维持真核细胞内外渗透压的平衡、细胞膜电位以及神经冲动产生等方面发挥着重要作用[1]。近十余年，科学家发现这种膜结合蛋白不但具有离子泵的功能，而且还具有信号转导功能[2]。

1 Na+,K+-ATP酶的结构

Na+,K+-ATP酶主要是由α、β亚基组成的二聚体[3]。近年来发现了γ亚基的存在，每个亚基具有多个亚型并且发挥着不同的生理作用[4]。

1.1α亚基 α亚基是催化亚基，相对分子质量为110 ×103[5]。目前发现它具有α1、α2、α3和α4四个亚型[6]。α亚基在组织中特异性表达，α1亚型占据主导地位，几乎在高等动物所有细胞都有表达；α2亚型主要表达于骨骼、心脏细胞和平滑肌细胞；α3亚型主要表达于神经细胞和心脏组织细胞；α4亚型仅仅表达于睾丸组织细胞，与精子的活性相关[7-8]。

1.2β亚基 β亚基是一个调节亚基,相对分子质量约为60×103，具有3个亚型：β1亚基普遍存在；β2亚基存在于脑组织、软骨细胞、表皮细胞和心脏组织细胞；β3亚基存在于脑组织、软骨细胞、表皮细胞以及肺脏的组织细胞。

β亚基的主要功能是协助新合成的α亚基正确折叠，从内质网转运到质膜，然后在质膜上稳定α亚基的蛋白构型以及调节α亚基的活性[9]。β亚基可以通过多个位点影响α亚基的活性，近年来研究发现β亚基对α亚基的调节作用具有两面性，不仅能够稳定α亚基的蛋白构型，而且还能够发挥抑制α亚基以及Na+,K+-ATP酶活性的作用[10]。

1.3γ亚基 γ亚基也是调节亚基，其相对分子质量约为60×103。该亚基属于苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸蛋白家族，这一家族具有保守的氨基酸序列，即苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸[11]。与β亚基不同，γ亚基不能单独作用于α亚基或β亚基，只能对已结合的αβ二聚体发挥调节作用。它可以通过其氨基酸序列的C末端作用于Na+,K+-ATP酶，增加Na+,K+-ATP酶对ATP的亲和力使ATP的水解加速。γ亚基还可以使Na+,K+-ATP酶对钾离子的亲和力增加，降低对钠离子的亲和力，增加离子转运的效率。

2 Na+,K+-ATP酶的配体

Na+,K+-ATP酶最主要的配体是强心甾类固醇(cardiotonic steroids,CTS)。Na+,K+-ATP酶和其他P类-ATP酶主要的区别是Na+,K+-ATP酶可以与CTS结合。CTS主要包括两大类：一类是植物来源的洋地黄类药物，如地高辛和哇巴因；另一类是脊椎动物来源的糖苷类药物，如蟾素和海蟾蜍素[7]。CTS与Na+,K+-ATP酶相结合后影响了钠离子和钾离子的转运，造成细胞内钠浓度升高，细胞内的钠离子和细胞外的钙离子进行交换，细胞内钙离子浓度升高，肌质网摄取钙离子增多，进而可以治疗心房颤动、充血性心力衰竭等疾病。在人体内，肾上腺和下丘脑能够分泌内源性的哇巴因和海蟾蜍素。作为内源性激素，CTS的分泌和产生受到血管紧张素Ⅱ和肾上腺素等激素的调节[12]。当机体在应激、缺氧和妊娠等情况时，内源性洋地黄物质产生和分泌增加，部分抑制Na+,K+-ATP酶的活性。体外实验表明，在一些病理和生理情况下，低浓度的CTS虽然不会抑制Na+,K+-ATP酶离子转运功能，但是可以引起细胞增殖和肥大，促进肿瘤细胞的凋亡，说明CTS与Na+,K+-ATP酶结合后可以触发信号转导通路的级联反应[7]。

细胞内钾离子和细胞外钠离子浓度的改变也可以引起Na+,K+-ATP酶构象的改变，进而引起膜电位变化和其他相关离子通道活动的变化，同时间接地诱发CTS介导的信号转导，因此钾离子和钠离子也可以被视为Na+,K+-ATP酶的另一类配体[13]。此外，活性氧类(reactive oxygen species,ROS)也可以引起Na+,K+-ATP酶结构的变化，ROS可以触发Na+,K+-ATP酶参与的信号转导效应，最终通过该转导通路促使线粒体产生更多的ROS。因此，ROS也可以视为Na+,K+-ATP酶的配体[14]。

3 Na+,K+-ATP酶信号微结构域

Na+,K+-ATP酶信号微结构域是位于细胞膜表面的特异性凹陷结构——膜穴，大多Na+,K+-ATP酶集中于该结构，可以使信号蛋白间作用区域化[15]。实验研究证明，使用微RNA(microRNA,miRNA)技术干扰小窝蛋白的表达或者去除膜穴中的胆固醇可以破坏膜穴的结构，使哇巴因触发的信号转导通路被阻断[16]。

小窝蛋白是膜穴的主要结构和调节成分，其N端氨基酸序列在细胞膜内表面形成脚手架样的功能区锚定多种信号分子[16]，这些信号因子包括异三聚体G蛋白、G蛋白偶联受体、酪氨酸蛋白激酶受体、蛋白激酶C、细胞内酪氨酸蛋白激酶Src家族成员、有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)途径组分、肌醇1,4,5-三磷酸受体、内皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)等。这些信号分子通过小窝蛋白结合序列与小窝蛋白的脚手架结构域相连接[17]。

4 Na+,K+-ATP酶信号转导通路

4.1Na+,K+-ATP酶/Src复合体 Src家族激酶是膜相关的非受体酪氨酸蛋白激酶。迄今Src家族至少有10个成员并且被分为两组：一组是广泛表达的酪氨酸蛋白激酶，如Src、Fyn和Yes；另一组表达于造血细胞中，如Fgr、Lyn、Hck、Lck、Blk、Lyn和Yrk[7]。Src主要包含Src同源结构域2(Src homology 2,SH2)、同源结构域3(Src homology 3,SH3)和激酶结构域三个重要蛋白作用位点。

在不同类型的细胞膜穴结构中存在着丰富的Na+,K+-ATP酶和Src表达，体外实验使用CTS分析Na+,K+-ATP酶和Src的结合位点，结果表明Na+,K+-ATP酶的α1亚基与Src相结合，它们之间至少是两个位点的结合，即α1亚基的第二胞质结构域(second cytosolic domain，CD2)和第三胞质结构域(third cytosolic domain，CD3)(CD2和CD3分别位于的α1亚基A结构域和N结构域)分别与Src的SH2和SH3结合[18]。在Na+,K+-ATP酶和Src结合的复合物中Na+,K+-ATP酶与哇巴因结合后Src的激酶结构域就会被释放，Src得以活化，进而激活下游信号级联反应。在这个过程中，可以把Na+,K+-ATP酶/Src复合物看作一种“二元”受体，受到CTS作用后间接地影响下游蛋白的磷酸化过程，触发信号转导反应。如果将PY-17细胞氨基酸序列上第420和425位点上的精氨酸突变为脯氨酸，Na+,K+-ATP酶离子泵功能虽然不受影响，但是CTS触发的信号转导通路被阻断[19]。Li等[20-21]根据人Na+,K+-ATP酶的α1亚基N结构域氨基酸序列，合成了大约含有20个氨基酸的多肽，即pNaKtide，该短肽可以竞争地与Src结合，Na+,K+-ATP酶的α1亚基就不能与Src组成复合体，Src不能被磷酸化，阻断了CTS触发的信号级联反应。

Na+,K+-ATP酶信号转导功能和其构象相关。Na+,K+-ATP酶在离子转运过程中经历了E1和E2两种构象的转化，E1状态对钠离子和ATP有较强的亲和力，释放钠离子后Na+,K+-ATP酶处于E2状态，易与细胞外的两个钾离子相结合。在E1状态时α1亚基的CD2和CD3可以同时与Src的SH2、激酶结构域相结合，使Src处于失活状态[21]，此时两者结合后相互作用形成了CTS功能性结合复合物。在离子转运过程的周期中Na+,K+-ATP酶由E1状态转化为E2状态时，Na+,K+-ATP酶释放耦联的Src[22]。

4.2Src转活EGFR触发的MAPK信号级联反应 EGFR是细胞因子、G蛋白偶联受体信号转导途径中的关键成员，在膜穴中发挥信号转导作用，也具有小窝蛋白结合序列。Haas等[23]观察到被哇巴因活化的Src可以与EGFR胞内区结合，EGFR第1172位的酪氨酸发生磷酸化，并激活p42/44 MAPK。Src可以转活ERFG，募集SH2包含蛋白、生长因子受体结合蛋白2以及Ras等调节蛋白至质膜，活化Ras/Raf/分裂原激活胞外信号调节激酶的激酶/胞外信号调节激酶级联反应。Haas等[23]分别使用非特异性酪氨酸激酶抑制剂Herbinycin A和Src激酶抑制剂PP2处理大鼠血管平滑肌A7r5细胞系和等位缺失Src家族基因的SYF细胞系，结果显示：哇巴因不能诱导上述信号蛋白活化；相反，在转染c-Src的SYF细胞系，哇巴因可以剂量依赖性地激活EGFR和p42/44 MAPK。实验结果表明，Src对EGFR的转活，参与了Na+,K+-ATP酶转导细胞外哇巴因的信号至细胞内p42/44MAPK的级联反应。Tian等[18]使用哇巴因作用于猪肾小管上皮LLC-PK1细胞系上Na+,K+-ATP酶，激活了Src激酶与EGFR耦联，继而引起瞬时和随后持续的细胞外信号调节激酶1和2激活，最终影响核内基因转录。

4.3磷脂酶C-γ和蛋白激酶C 哇巴因可以通过磷酸化磷脂酶C-γ(phospholipase C-γ,PLC-γ)第783位的酪氨酸激活PLC-γ，激活的PLC-γ以一种Src依赖的方式增强对磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸进行水解，产生1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphosphate,IP3)和二酯酰甘油[24]。同时，哇巴因还可以促进IP3受体酪氨酸的磷酸化，从而激活IP3受体，IP3受体对IP3的敏感性增强。此外，如上所述Na+,K+-ATP酶还发挥脚手架功能，通过不同的结构域分别与PLC-γ和IP3受体连接使其成为信号复合体。该信号复合体有利于PLC-γ催化产生的IP3和IP3受体相互作用，产生相应的生物效应。

4.4ROS信号转导途径和细胞内游离钙离子 Na+,K+-ATP酶的信号转导通路中Src转活EGFR，进而活化Ras后还可以使线粒体产生ROS增多，ROS又可以引起Na+,K+-ATP酶的结构改变，从而放大Na+,K+-ATP酶的信号[25-26]。

细胞内游离钙离子在Na+,K+-ATP酶信号转导过程中发挥着重要的作用。Na+,K+-ATP酶介导的MAPK信号途径中可激活L型Ca2+通道蛋白磷酸化，导致钙离子内流，细胞内游离钙离子浓度升高，后者通过Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶作用于分裂原激活胞外信号调节激酶的激酶，促进MAPK通路的活化，产生信号扩大作用。

5 Na+,K+-ATP酶信号转导对细胞生长的影响

5.1Na+,K+-ATP酶信号转导与细胞增殖 有研究将使用哇巴因作用于原代培养的大鼠心肌细胞，结果表明CTS可以触发Na+,K+-ATP酶信号转导级联反应造成心肌细胞增殖，最终导致心肌肥大[2]。Na+,K+-ATP酶介导的信号转导不但可以引起与细胞生长有关的早期反应基因c-fos和c-jun的转录，还可以引起与心肌细胞肥大有关的晚期反应基因(骨骼肌肌动蛋白1、心房肽、肌球蛋白轻链2和转化生长因子β)的表达增加。Tian等[25]分别使用10 nmol/L和50 nmol/L浓度的哇巴因作用于猪肾小管上皮细胞LLC-PK1细胞系24 h，结果表明CTS可以刺激LLC-PK1细胞显著增殖。

5.2Na+,K+-ATP酶信号转导与细胞凋亡 近年来，许多研究表明Na+,K+-ATP酶α亚基可能是一个新的抗肿瘤靶点。Kometiani等[26]使用10 nmol/L和50 nmol/L浓度的哇巴因处理缺少雌激素受体的乳腺癌MDA-MB-435s细胞系96 h，结果显示CTS可以引起乳腺癌细胞凋亡，CTS与其受体Na+,K+-ATP酶相互作用继而触发了细胞调控蛋白p21Cip1的活化。Makihira等[27]使用CTS处理非小细胞肺癌细胞株，结果癌细胞增殖和迁移明显受损，结果表明Na+,K+-ATP酶α1亚基下调可以诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡。Tian等[25]使用CTS分别作用于乳腺癌细胞系BT20和前列腺癌细胞DU145导致两种细胞的凋亡，并且检测细胞调控蛋白p21Cip1被活化。Yin等[28]使用蟾素作用于骨肉瘤细胞U-2OS细胞系，引起细胞凋亡，检测到CTS与其受体Na+,K+-ATP酶结合后触发细胞调控蛋白p21Cip1、p53和Bax的上调。

5.3Na+,K+-ATP酶信号转导与细胞融合 破骨细胞的前体来源于造血干细胞，一部分造血干细胞在转录因子的调控下分化为前破骨细胞，前破骨细胞在核因子κB受体活化子配体的诱导下融合为多核的破骨细胞，最后分化为成熟的破骨细胞。Makihira等[27]使用哇巴因作用于大鼠前破骨细胞，结果表明即使在核因子κB受体活化子配体的诱导下前破骨细胞也不能融合为破骨细胞，但是由Na+,K+-ATP酶触发了哪条信号转导通路仍不清楚。

6 小 结

Na+,K+-ATP酶不但具有离子泵功能，而且具有信号转导功能。CTS通过调节Na+,K+-ATP酶的表达进而影响不同细胞的生长、增殖和凋亡，已有研究证明哇巴因等药物可以用以治疗前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤以及心肌细胞肥大，为心血管疾病、恶性肿瘤等疾病的治疗提供了新方法。近年来，一些初步的实验结果通过药物干预Na+,K+-ATP酶的表达或许可以治疗骨质疏松症、骨关节炎、Paget病等代谢性骨病和退行性骨关节疾病，为这些疾病的治疗提供了新思路[29]。但是，目前对Na+,K+-ATP酶参与的信号转导机制的认识仍然是粗浅的，更复杂的信号转导机制还有待于进一步研究。

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