Pim-1基因在心血管疾病基础研究中的进展

邓晓江，钟如智，黄师韵，叶楚莉(综述)，揭 伟(审校)

(广东医学院 1第一临床学院， 2基础学院病理学教研室，广东 湛江 524023)

丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1基因最早是作为莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入点而被发现[1]，Pim家族还包括另外2个成员，即Pim-2和Pim-3，它们都包含一个被称为ATP锚的活化位点。Pim-1基因产物属于钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶，并在多种细胞组织进化过程中高度保守[2]。Pim-1基因与细胞存活、增殖、分化、凋亡有关。Pim-1激酶在肿瘤中的作用已受到重视[3-6]。近年来发现，Pim-1激酶在血管平滑肌细胞[7-9]、心肌细胞[10]及血管内皮细胞[11-12]中均有表达，提示Pim-1表达异常在心血管疾病中起重要作用。现就Pim-1基因在心血管疾病基础研究中的进展予以综述。

1 Pim-1基因与心肌梗死

心肌组织中Pim-1的表达与年龄相关。Pim-1高度表达于新生个体心脏中，但随着年龄的增加，表达逐步降低。在细胞定位方面，小鼠幼稚心肌细胞中Pim-1多表达于细胞核，随年龄的增长，其在细胞质中的表达逐渐增多[13]。Pim-1细胞内定位机制尚未清楚，目前认为其核内表达可促进细胞增殖，而细胞质中的表达可促进细胞存活[13-14]，因此Pim-1的功能与细胞内定位有关。心肌梗死后，Pim-1表达水平上调，并以心肌梗死灶周围残存的心肌细胞胞质表达为主[13]。研究发现，心肌梗死后氧化应激的存在可能是诱导Pim-1表达及增加Pim-1蛋白磷酸化水平的重要机制[8,15]。Pim-1表达上调后可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤[16]。其他一些心肌保护因子(如红细胞生成素、干细胞因子等)可显著增加Pim-1的表达，所以Pim-1基因被认为是一种心脏保护因子。

Pim-1基因对心脏的保护作用可能与维持线粒体稳定性、通过Bcl-2蛋白抗凋亡、抗心肌肥大及减少纤维化等方面有关[17]。这些作用已通过Pim-1转基因动物实验证实。Borillo等[18]发现，心肌缺血再灌注损伤可诱导心肌细胞线粒体中Pim-1表达增加，从而稳定线粒体膜电位，防止钙超载引起的线粒体膜受损以及干扰氧化磷酸化过程，从而维持线粒体的超微结构；同时，心肌细胞高表达Pim-1可提高抗凋亡基因Bcl-x(L)和Bcl-2的表达水平、抑制促凋亡Bid蛋白触发的细胞色素C释放，从而增加了心肌细胞的抗凋亡能力。在Pim-1基因缺陷的心肌细胞中发现，保护性线粒体相关蛋白包括Bcl-x(L)和Bcl-2表达水平下降，肌质网对钙重新摄取障碍及其引起的肌原纤维松弛，这些可能是由于肌质网/内质网Ca2+ATP酶2a(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA2a)和钠/钙交换因子表达减少造成的[13]。钙调节功能的失调增加了线粒体对Ca2+渗透性并促进活性氧生成，增加细胞凋亡，导致心肌细胞的死亡[18]。

由于Pim-1能增强心肌的再生能力，因而提出了基于Pim-1转基因干细胞治疗心肌梗死的策略[13,19-22]。Pim-1通过诱导c-myc、核干细胞素和细胞周期素E的表达来稳定有丝分裂复合体及降解细胞周期素激酶抑制因子p27和p21，从而提高细胞的存活和增殖能力。作为Pim-1上游基因的蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)在心肌细胞核内表达后可促进心肌细胞周期循环，并增加心脏祖细胞(cardiac progenitor cell,CPC)的数量[23]，从而起到保护心肌的作用[24]。应用小干扰RNA抑制Akt信使RNA后可下调血管内皮细胞中Pim-1的表达[12]。然而，心肌特异性Pim-1过表达转基因小鼠其心脏中CPC的数量较野生型小鼠出生或心肌梗死应激后未见明显增加[24]，进一步研究发现，Pim-1过表达可促进CPC非对称性染色体分裂，并短暂性提高端粒酶活性，从而维持CPC数量[25-26]。Fischer等[21]和Mohsin等[22]在心肌梗死区植入Pim-1过表达的CPC后发现，其较植入野生型CPC具有更高的细胞移植率和更佳的远期心功能改善效果，进一步从整体水平上证实了靶向Pim-1基因在心肌梗死治疗中的价值。

2 Pim-1基因与疾病

2.1Pim-1基因与心肌肥厚 Muraski等[20]研究发现，在Pim-1基因敲除的小鼠中虽未发现明显的心肌病变，但却加速了心肌细胞的凋亡过程，而在过度表达显性失活的Pim-1基因中，除了发现体外心肌细胞凋亡外，还可观察到3～4个月的小鼠左心室纤维化增加及胶原蛋白沉积，心肌坏死加重，导致心脏向扩张型心肌病发展。虽在这个过程中代偿性地上调了Pim-2和Pim-3基因的水平，但并不能抑制心肌病变的发展[13]；以野生型Pim-1腺病毒过表达质粒(Pim-WT)转染于内皮素1诱导的大鼠心肌细胞24 h后，发现Pim-WT的过度表达可抑制大鼠内皮素1诱导的心肌细胞肥大[20]。Pim-1过表达后心肌细胞内保护性蛋白SERCA2a水平、p21过磷酸化以及抗凋亡蛋白(如Bcl-xL、Bcl-2)水平都明显增加，并且提高了Bad蛋白的磷酸化水平，使其失活，从而降低心肌纤维化、减少心肌坏死，改善心肌活力，维持心脏的收缩功能[13]。

2.2Pim-1基因与糖尿病性心肌病 糖尿病易导致心肌细胞损伤。Katare等[27]发现，链脲佐菌素诱导的小鼠1型糖尿病心肌中，Pim-1蛋白的表达水平随心肌病变的加重而逐渐降低，相应的Pim-1抑制因子——蛋白磷酸酶2A和微RNA1的表达水平上调。在Pim-1蛋白水平下降后，糖尿病性心肌细胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2的水平降低、促凋亡胱天蛋白酶3的活性升高，通过下调微RNA1后，Pim-1和Bcl-2的表达均得到相应上调；糖尿病性心肌细胞在转染Pim-1过表达质粒后，可抑制体外高糖诱导的心肌细胞以及CPC凋亡。在诱导糖尿病模型第4周后通过静脉注射Pim-1过表达腺病毒质粒，可使心肌细胞内Pim-1持续过表达，从而改善心肌舒张功能，防止左心室过度扩张及心力衰竭，并增加糖尿病心脏心肌细胞处于增殖期细胞的数量。Katare等[27]的研究结果提示，Pim-1在抗糖尿病性心肌细胞损伤中具有抗细胞凋亡和促进细胞增殖的作用。研究还发现，Pim-1的高水平表达降低了线粒体内膜电位极化，提高了心肌细胞抗氧化应激能力，防止了Ca2+超载，保护了心肌细胞线粒体的完整性[18]，降低了糖尿病心肌细胞活性氧水平[27]，提高了心肌细胞肌质网Ca2+-ATP酶活性，从而改善了心脏功能[13]。

2.3Pim-1基因与血管平滑肌增殖相关性疾病 血管重构性疾病，如高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等的特点是血管中膜增厚以及内膜新生，这一重构过程主要是由血管平滑肌细胞增殖以及细胞凋亡失调导致的[28]。Katakami等[8]首次报道Pim-1基因在球囊损伤后的大鼠颈动脉血管狭窄模型以及内膜增厚的人冠状动脉中表达增加。抑制Pim-1的表达后，在体内可显著抑制球囊损伤所导致的血管内膜新生，在体外则延缓H2O2或血清诱导的平滑肌细胞周期的进展。Katakami等[8]的研究结果首次提出Pim-1的表达与平滑肌增殖呈正相关。Willert等[9]的研究结果提示，氧化应激、血管内皮生长因子A165和血管紧张素Ⅱ并不能增加血管平滑肌细胞中Pim-1的表达，而给与血小板源性生长因子-BB刺激后，Pim-1信使RNA的表达较对照组增加了3倍，其蛋白表达亦增加。进一步分析发现，Janus活化的蛋白激酶，蛋白激酶C以及有丝分裂原激活蛋白激酶1/2信号的活化参与血小板源性生长因子-BB诱导的Pim-1表达[9]。然而，与Akt信号在血管内皮细胞中的作用相反[12]，阻断Akt信号并不干扰Pim-1表达的上调，表明了其信号调节的独立性。Willert等[9]的研究提出了Pim-1参与血管重构性疾病可能的分子机制。Meloche等[7]将新分离的人颈动脉血管平滑肌细胞暴露于晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)活化剂48 h后，可激活信号转导子与转录活化子3(signal transducers and transcription activators 3,STAT3) 并增加Pim-1和活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)的表达。Pim-1可促使NFAT激活，而NFAT可减少Kv通道的开放，导致平滑肌细胞胞膜去极化，此去极化可刺激增殖的长效电压门控钙通道开放，增加钙的摄入量，从而增强血管平滑肌细胞增殖和抗凋亡能力，促进血管重构疾病表型转化。相反，当给予RAGE抑制剂或针对Pim-1、STAT3和NFAT的siRNA后可逆转在上述人颈动脉平滑肌细胞暴露于RAGE活化剂中出现的异常。上述研究提示，STAT3/Pim1/NFAT信号轴的活化在血管重构性疾病中的作用。近期研究发现，STAT3/Pim1/NFAT信号轴的活化在人类和实验动物模型的肺动脉高压中起关键作用，该信号活化后促进了平滑肌细胞的增殖和抗细胞凋亡[29]。本课题组近期研究发现，在链脲佐菌素诱导的急性糖尿病大鼠胸主动脉平滑肌细胞中Pim-1的表达较正常对照组明显升高；体外高糖(25 mmol/L)刺激可明显诱导原代大鼠胸主动脉平滑肌细胞Pim-1表达，并伴随细胞增殖基因表达的增加，以及细胞周期的相应变化，而给予Pim-1抑制剂槲皮万寿菊素后抑制了高糖刺激诱导的平滑肌细胞的增殖。因此，糖尿病性动脉粥样硬化一个发病机制可能与高糖刺激Pim-1表达而诱导血管平滑肌细胞增殖有关(待发表资料)。

2.5Pim-1基因与心血管疾病的治疗 目前国外关于Pim-1基因在心血管疾病分子靶向治疗中的研究逐渐受到重视，但国内相关研究甚少。当前以美国圣地亚哥州立大学心脏研究所的Sussman团队的研究成果居于前沿地位。其团队发现，Pim-1通过上调nucleostemin的表达进而维持端粒的长度[30]；Pim-1转基因心脏干细胞能增加细胞周期循环和不对称分裂，影响心脏干细胞数目，有利于保存心脏干细胞池，以及提供心源性损伤修复所需的种子细胞[21,24-26,31]，因此，基因工程修饰的Pim-1过表达于心脏干细胞对缺血性心脏病细胞的治疗可能是一种有效的选择[32]。在具体操作上，为了避免全身非心脏器官的细胞受Pim-1表达的影响，应选择特异性针对靶器官或细胞的条件诱导方法[33]。在治疗糖尿病性心肌病时，给予维生素B1类似物苯磷硫胺可通过调节Akt/Pim-1信号而提高心肌细胞的活性及功能[34]。鉴于STAT3/Pim1信号轴在肺动脉高压的发病中也起了关键作用[35]，因此靶向干预Pim-1的表达对肺动脉高压的治疗将有益处。

3 小 结

鉴于Pim-1基因表达失常与缺血性心肌损伤、肺动脉高压及血管重构性疾病等重要心血管事件的密切关联性，凸显了靶向Pim-1分子治疗的可行性和有效性。目前，在肿瘤研究领域中，针对Pim-1表达产物的特点来设计特异性化学抑制剂的研究正蓬勃发展。在今后，通过移植基因工程过表达Pim-1治疗心肌梗死等缺血性心肌损伤或应用Pim-1特异性化学抑制剂来治疗肺动脉高压、动脉粥样硬化等涉及平滑肌细胞增殖性疾病将是一种可行性和有效性很强的策略。

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