DNA异常甲基化在胃癌中的研究进展

孙婧悦(综述)，何敬东(审校)

(南京医科大学附属淮安第一医院肿瘤科，江苏 淮安 223300)

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，在CpG二核苷酸中将甲基转移到胞嘧啶的第5位碳原子上形成5-甲基胞嘧啶。该过程不涉及核苷酸序列的变化，而属于表观遗传学改变的范畴，是一种具有可逆性和可遗传性的基因修饰方式。在整个人类的基因组中，CpG二核苷酸非均匀分布，并且有两种存在方式：一种为散在分布且处于甲基化状态；另一种富含CpG，长度>200 kb，呈非甲基化状态，即CpG岛[1]。在恶性肿瘤细胞中，DNA异常甲基化主要表现为广泛低甲基化和局部CpG岛启动子的高甲基化，目前后者的报道相对较多[2]。相关研究表明，广泛低甲基化会引起染色质缺失及重组，从而导致基因不稳定，这种不稳定性的累加最终促使肿瘤的发生[3]。局部高甲基化通常发生在抑癌基因CpG岛的启动子区域，使抑癌基因表达沉默，导致肿瘤的发生[4]。胃癌中存在很多基因的异常甲基化，在疾病进展的各个阶段均可检测到DNA异常甲基化的存在[5]。因此，检测胃癌相关基因的甲基化状态，可以为胃癌的发生、发展、早期诊断、药物治疗及预后评价提供新的思路。

1 DNA异常甲基化与胃癌的发生、发展

胃癌的发生、发展伴随有许多基因的低甲基化和高甲基化。前者主要涉及原癌基因及广泛基因组的低甲基化，后者主要指抑癌基因CpG岛启动子区域的高甲基化。目前已有很多文献报道与胃癌发生发展相关的甲基化基因，如RUNT相关转录因子3、人类错配修复基因1、金属蛋白酶组织抑制物3、抑癌基因p16等，它们的功能分别是调节基因转录、参与DNA修复、涉及细胞生长分化、调控细胞周期等多方面[5-8]。上述基因的异常甲基化在肿瘤细胞形成的各个阶段发挥不同的作用，下面重点介绍几个新近发现与胃癌发生、发展相关的基因。

1.1早期B细胞因子3 早期B细胞因子3(early B-cell factor-3，EBF3)是一种抑癌基因，位于人类染色体10q26.3区域，由551个氨基酸残基构成，相对分子质量约60×103，含有家族性非典型锌指及螺旋结构，其基本功能是调控细胞分裂周期，促进细胞凋亡。EBF3启动子区域高甲基化导致表达沉默，被认为是胃癌的发病因素之一，目前已在胃癌组织中得到了证实。Kim等[9]研究发现，在104例胃癌组织中，有42例检测到了EBF3启动子区域高甲基化，甲基化率为40.4%，而EBF3在正常的胃黏膜组织中，未发现异常甲基化。功能分析表明，EBF3抑制胃癌细胞的生长和转移，促进细胞周期停滞及凋亡。因此，在胃癌组织中高甲基化状态的EBF3导致蛋白表达下调，使肿瘤细胞的生长不受调控，从而引起胃癌的发生与发展。

1.2原钙黏素10 原钙黏素10(protocadherin 10，PCDH10)是一种重要的抑癌基因，位于人类染色体4q28.3区域，长度约42.26 kb，为原钙黏素细胞黏附分子家族的成员之一，其基本功能是参与钙依赖型细胞间黏附，介导细胞间的信号转导。Yu等[10]研究发现，在17种胃癌细胞系中有16种检测到PCDH10表达沉默或下调。此外，在104例胃癌患者中，85例存在PCDH10高甲基化，甲基化率为82%，而相对应的104例癌旁组织中，仅有38例检测到PCDH10高甲基化，甲基化率为37%，两者比较差异有统计学意义。PCDH10重新获得表达后，能够抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，阻止细胞侵袭生长。PCDH10不仅参与胃癌的发生、发展，在其他肿瘤的形成中也有作用，已有文献报道，PCDH10异常甲基化与结直肠癌、非小细胞肺癌等肿瘤的发生、发展相关[11-12]。

1.3促生长素抑制素 促生长素抑制素(somatostatin，SST)为一种肠肽，可以阻止胃癌等多种癌症中肿瘤细胞的生长，其广泛分布于胃肠道，在维持内环境的稳定中起重要作用。有研究表明，在人类恶性肿瘤中，SST有抑癌基因的功能，可以通过调控生长因子和激素的释放、减少血管形成等机制抑制肿瘤的生长[13]。Shi等[14]研究发现，在51例胃癌组织中，通过定量的甲基化特异性聚合酶链反应技术检测SST启动子区域甲基化水平，发现23例SST发生高甲基化，甲基化率为45.1%，而相对应的51例正常胃黏膜组织中，用同样的方法只检测出2例SST高甲基化；此外分别用放射免疫分析法和反转录聚合酶链反应检测SST蛋白及信使RNA水平，发现胃癌组织中的SST表达水平显著低于正常胃黏膜组织。这一研究提示，在胃癌中基因高甲基化是SST表达沉默的主要原因，而SST作为抑制肿瘤细胞生长的因子，其表达下调或缺失会导致胃癌等消化道恶性肿瘤的发生。

2 DNA异常甲基化与胃癌的早期诊断

胃癌在全球具有很高的发病率和病死率，尽管诊断技术有所改进，但仍有很多患者在疾病晚期才能被确诊，而这类患者的生存期较短，预后相对较差。所以，胃癌的早期诊断显得尤为重要。目前，很多胃癌相关基因的异常甲基化已经被证实，越来越多的研究表明，在胃癌形成的早期阶段，DNA的异常甲基化导致表达沉默的现象便已出现[15]。因此，通过甲基化特异性实时定量聚合酶链反应、亚硫酸氢盐测序法、亚硫酸氢盐焦磷酸测序法等技术测定相关基因的甲基化状态，对于胃癌的早期诊断有一定的临床价值。

2.1血浆中游离DNA异常甲基化与胃癌早期诊断 根据相关文献的报道，在胃癌患者的血浆中已经发现死亡相关蛋白激酶K(death-associated protein kinase，DAPK)、上皮钙黏素、谷胱甘肽S转移酶P1、抑癌基因p15、p16等基因的异常甲基化，它们是由胃癌细胞中参与循环的核酸释放入血浆，与胃癌组织中的基因异常甲基化密切相关，可以作为一类生物标志物，应用于胃癌的诊断[16]。Lu等[5]研究发现，血浆中游离RUNT相关转录因子3的高甲基化在胃癌的早期诊断及术后评估中有重要的意义。此外，p16启动子区域的高甲基化被认为是胃癌发生的早期分子事件，因此在血浆中检测p16基因的甲基化水平可以用来诊断早期胃癌[17]。同胃癌组织类似，胃癌患者血浆中也存在多种基因共同发生异常甲基化[18]。

2.2胃液中脱落肿瘤细胞DNA异常甲基化与胃癌早期诊断 由于DNA在胃酸的作用下容易发生变性，因此胃液脱落细胞检查不能作为胃癌诊断的一个手段。然而胃液中可以找到很多黏膜细胞，所以在胃液中寻找胃癌脱落细胞，并检测其DNA甲基化状态，可能成为胃癌早期诊断的一种非侵入性方法。已有文献报道，在胃癌患者的胃液中成功检测到了MINT25、RORA、胶质细胞源神经营养因子、整合素-金属蛋白水解酶23、PRDM5以及髓细胞白血病因子1基因的异常甲基化，其中MINT25基因的甲基化在胃癌的早期诊断中具有较高的灵敏度(90%)和特异度(96%)[19]。这些研究说明，检测胃液中脱落胃癌细胞的DNA甲基化水平，可以为胃癌早期诊断提供新的选择。

3 DNA异常甲基化与胃癌的药物治疗

DNA异常甲基化是一种可逆的表观遗传学改变，在胃癌细胞中许多抑癌基因发生高甲基化及表达沉默，因此通过去甲基化药物可以使抑癌基因脱甲基化，重新获得表达，从而抑制肿瘤生长。基因高甲基化是通过DNMT的作用发生的。研究发现，DNMT的异常表达在包括胃癌等肿瘤的形成中起着重要作用[20]。因此，DNMT抑制剂被认为是治疗肿瘤的新型药物。DNMT抑制剂主要有两大类，核苷酸类与非核苷酸类[21]。有关核苷酸类的研究报道较多，以5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)和5-氮杂-2′-脱氧胞苷(地西他滨)为代表，分别于2004年和2006年被美国食品药品管理局批准，用于骨髓增生异常综合征和急性粒细胞白血病的治疗[22]。但是，目前尚未开展针对胃癌药物治疗的临床试验。非核苷酸类DNMT抑制剂研究较少，其结构多变，根据抑制机制的不同而不同，包括生物类黄酮、染料木黄酮等，但是均未进入临床研发。因此，非核苷酸类DNMT抑制剂应用于肿瘤的药物治疗，仍需要进一步探索和努力。

此外，DNA异常甲基化还与胃癌细胞对药物的敏感性相关。一些化疗药物通过损伤肿瘤细胞的DNA从而诱导细胞凋亡。然而，凋亡相关基因一旦出现异常甲基化，导致凋亡信号途径失活，则化疗药物不易引起肿瘤细胞凋亡，该现象被认为与化疗耐药相关。Sugita等[23]研究报道，在80例胃癌术后接受氟尿嘧啶为基础的化学治疗患者标本中，用甲基化特异性实时定量聚合酶链反应检测凋亡相关基因Bcl-2/腺病毒E1B19 kD相互作用蛋白3和DAPK的甲基化状态，两者的甲基化率分别为39%、41%，甲基化的Bcl-2/腺病毒E1B19 kD相互作用蛋白3和(或)DAPK对氟尿嘧啶为基础的化疗药物敏感性较未发生甲基化者差，两者比较差异有统计学意义，提示两者对氟尿嘧啶类化疗药物耐药。Ivanova等[24]研究发现，胃癌细胞中骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)启动子区域的甲基化水平与表达呈负相关，其甲基化及表达状态有望成为胃癌细胞顺铂耐药的一个标志，针对BMP4的靶向治疗能增加胃癌细胞的敏感性，并且BMP4的表达对奥沙利铂没有交叉耐药现象。该研究提示，BMP4表达阳性的患者临床上可以使用奥沙利铂替代顺铂进行有效的化学治疗。上述DNA异常甲基化与药物敏感性研究可以应用于临床指导个体化用药，为胃癌患者选择最有效的化学治疗方案。

4 DNA异常甲基化与胃癌的预后评价

胃癌患者的预后取决于确诊时的临床分期及有效的治疗方式，因此早期诊断及最佳的治疗是胃癌患者预后最好的保证。DNA异常甲基化不仅有助于胃癌早期诊断及化疗药物的个体化选择，而且对患者的预后有一定的提示作用。Bae等[25]研究发现，长散在核元件1(long interspersed nucleotide element-1，LINE-1)甲基化水平依照肠上皮化生、胃腺瘤、胃癌的发展顺序逐渐下降，并且LINE-1低甲基化与不良的预后密切相关。Shigaki等[26]也发现，LINE-1在胃癌组织中甲基化水平较正常胃黏膜组织低，LINE-1低甲基化提示总体生存率较低，预后不良。2013年，有韩国学者报道，提取53例行胃癌切除术患者的术前及术后10 d血浆DNA，甲基化特异性实时定量聚合酶链反应检测p16甲基化水平，得出甲基化率分别为79.2%和54.7%，且术后p16甲基化消失者较术后未消失者的生存期更长久[27]说明，p16异常甲基化与患者的预后有一定的关联性。

5 小 结

DNA异常甲基化在胃癌的发生和发展、早期诊断、药物治疗及预后评价中均起到一定的作用，但是仍然存在许多问题。胃癌患者体内有多种基因发生异常甲基化，而目前甲基化检测手段很有限，需要进一步提高其敏感性和特异性，以便早期诊断胃癌，尽早实现针对某一基因的靶向治疗，延长胃癌患者的生存期。另外，基因异常甲基化是一种可逆的表观遗传学改变，可以认为DNMT抑制剂治疗肿瘤同样是一个可逆的过程，经治疗一段时间后，基因可能会恢复到原来的甲基化状态，导致治疗失败。同时，药物治疗剂量及不良反应有待于进一步探究。相信随着分子生物学技术的不断发展及研究的不断深入，以上问题将会得到解决。

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