间充质干细胞治疗周围神经损伤的研究进展

张 杰(综述)，肖玉周(审校)

(蚌埠医学院第一附属医院骨科，安徽 蚌埠 233004)

周围神经损伤原因有外科创伤、肿瘤切除、糖尿病足等，因其结构上的脆弱性和功能上的复杂性，所以一旦损伤就会造成支配区域的感觉运动和自主神经的功能障碍。临床上遇到此类病例主要是采用直接缝合法、自体神经移植或异体甚至异种神经移植，但以上几种方法的自身缺点而限制了其在临床中的应用。随着生物技术的发展，组织工程学应运而生，其三要素是支架、种子细胞和营养因子。种子细胞由施万细胞到后来的基质干细胞，再到诱导的类施万细胞。该文主要就种子细胞即施万细胞及其前体细胞间充质干细胞的研究进展予以综述，重点在目前还未解决的问题，以期为进一步的研究重点做铺垫。

1 周围神经损伤的病理生理变化

针对长段的神经缺损人们已经进行了大量的基础研究和部分的临床试验，证实选择合适的人工神经移植物对修复一定长度的神经缺损有促进作用[1]。施万细胞是周围神经中重要的胶质细胞。研究发现周围神经受损后，局部发生变性，施万细胞大量增生形成Bungner带，并与周围的巨噬细胞一起吞噬清除变性的轴突和髓鞘裂解物，并能分泌包括神经生长因子在内的神经营养因子[2]。虽然施万细胞是修复周围神经的优质种子细胞，但要将其用于组织工程还有很多困难。施万细胞的来源主要有三个，即自体施万细胞分离增殖、异体施万细胞分离增殖、干细胞增殖分化。自体施万细胞因其来源有限且会造成供区的神经缺损，异体施万细胞因存在排斥反应而使前两者应用受到限制。因此，研究者把目光转向了干细胞的分离扩增分化上来。这一研究可能会使既往认为的神经组织不可修复不可再生的观点得以改变[3]。

2 间充质干细胞的特性

间充质干细胞是存在于结缔组织和器官间质中的一种具有强大的繁殖能力、多向分化潜能及免疫调节功能的来源于中胚层的细胞,是一种具有高度的自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，因其具有免疫调控、分泌细胞因子等作用而成为细胞治疗的理想种子细胞[4]。在一定的诱导条件可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和再生能力极差的神经细胞[5-6]。不仅可用于组织工程，还可为其他细胞的生长繁殖提供支持。因具有来源广泛、易于分离提纯扩增等优势而日益成为研究热点[7]。除此之外,间充质干细胞还有如下特性：①“归巢”性，即像免疫细胞一样，有向受伤或有炎症的局部迁徙的特性；②低免疫原性，目前临床已有大量利用间充质干细胞治疗移植物抗宿主病和自身免疫病，这足以证明其免疫原性弱[8]。间充质干细胞是成体干细胞的一种，具有很高的可塑性及自我繁殖能力，主要来源于骨髓、脂肪、脐带血、脐带等。对间充质干细胞的鉴定及纯度的测定是非常重要的,因其缺乏特异性的表面标志物，因此只能通过检测一系列的分子指标来鉴定[9]。目前比较公认的是国际细胞疗法学会制订的标准：①体外培养具有贴壁性；②表面分子需表达CD105、CD73、CD90，不表达CD34、CD45、CD19等；③有自我更新能力及多向分化潜能[10]。

3 间充质干细胞的研究历程及各自特点

研究最早的间充质干细胞是骨髓来源的，也是目前研究技术相对成熟的施万细胞来源，已证实其可分化为骨、软骨、脂肪等细胞，且免疫原性也较低。但是随着研究的进展也发现了骨髓来源的间充质干细胞有很多不足之处，主要有取材时会对供体造成伤害或感染，随着供者年龄的增大干细胞数量下降及增殖和分化能力会降低[11]。胚胎干细胞因涉及法律和伦理的问题而使研究受到限制。新世纪以来又有学者发现脐带血中亦含有间充质干细胞，并有来源丰富、取材无创、增殖能力强、免疫原性弱、无伦理学争议、无肿瘤细胞、费用低等优势,且其治疗效果不亚于骨髓来源的间充质干细胞[12-13]。有研究表明,脐血间充质干细胞可以分泌细胞因子和神经生长因子等，在疾病治疗方面起重要作用[14]。但脐血来源的间充质干细胞含量少，据统计只有25%脐血的单核细胞培养出间充质干细胞，其余75%培养出破骨样细胞[15]。脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的表面标志物区别在于脐血的CD90和CD166的表达水平高于骨髓来源的间充质干细胞，提示脐血来源的间充质干细胞的骨祖细胞含量较丰富。

4 国内外研究已取得的进展

目前多数研究者认为间充质干细胞的修复机制可能是旁分泌机制，即细胞移植入体内后大部分死亡，释放膜微囊趋化并调节周围细胞的功能，少数存活的细胞通过分泌大量的小分子物质发挥作用[16]。针对间充质干细胞难培养，尤其是获取早期数量比较少的情况，现有研究发现生物反应器3D的培养模式效果比较好，因为其在相同的体积下培养的表面积比较大，系统封闭，种植和收获可以自动化[17]。通过对细胞植入体内后的跟踪发现一种纳米粒技术，能够抵御体内的干细胞代谢性降解，是长期跟踪干细胞发展的一种好方法，可以探究移植物从植入到凋亡的全过程[3]。现已发现端粒酶在维持细胞染色体的稳定性方面起着重要的作用，因此研究端粒酶对检测及预防细胞的凋亡会有一定的作用。间充质干细胞与许旺细胞在体外共培养可促进干细胞向施万细胞的分化[18]。有研究表明，骨髓来源的施万细胞在受损髓鞘局部有再生的能力[19]。现已证明贴壁实验是目前检测细胞活性较为实用的一种方法[20]。间充质干细胞用于修复周围神经途径主要有以下几个方面：①直接注入受损区域；②诱导为施万细胞后注入受损区域；③制成人工神经移植物植入受损区。有研究表明,直接注入处理后的脐带血间充质干细胞对糖尿病足引起的周围神经损伤的修复有促进作用[21]。组织移植安徽省重点实验室已成功把骨髓和脐带血间充质干细胞体外诱导为施万细胞并进行了相关的鉴定，对诱导方法进行了优化，在动物体内模型进行了研究并证实了由脐血间充质干细胞诱导而来的施万细胞对修复大鼠坐骨神经受损有促进作用。现在研究者已认识到分化是细胞和环境相互作用的结果，主要是通过调控基因的表达起作用。五代以内的间充质干细胞可自行分泌腺苷三磷酸分子，并可与细胞膜结合后改变膜内外电位，从而引起膜电位变化[22]。经典的Wnt通路参与了间充质干细胞的分化调控[23]。反复的微热刺激能够防止衰老的进展，这为其大规模的扩增增加了更多的机会。间充质干细胞的转分化机制目前主要有三种学说，即异质性学说、核重编程学说(包括细胞融合)和胚胎干细胞残存学说。

5 大量应用于临床前尚需解决的问题

目前存在的不足和问题，主要分为以下几个方面：①神经受损后修复的速度非常慢，修复后功能的恢复有待考证。②神经移植物在体内是否能降解，降解的速度是否和神经恢复的速度相适应。③运动神经的恢复速度比感觉神经快，是否会引起感觉与运动不协调。④受损后的神经恢复很难达到之前正常的水平。⑤诱导后植入体内的细胞是否残存有诱导剂及其对体内正常细胞的毒性尚不知晓。⑥有报道称肿瘤是间充质干细胞异常分化而来的，因此植入的细胞是否有恶变及其比例需进一步研究[24]。⑦机体局部受损后多处于相对缺氧和缺血状态，会影响植入的施万细胞活性的表达。⑧目前的大多实验还处于实验室阶段，是人工模拟的环境，但真实的体内环境极其复杂，势必会对植入物产生一定的影响。⑨周围神经修复和功能的评价目前还没有统一的标准，可能使不同的实验缺乏对比性。⑩移植物移植到体内后是否稳定，有无“返祖”现象。有报道称直接把间充质干细胞注入体内的效果优于诱导后的施万细胞，因此诱导的必要性需要进一步研究[25]。人工神经植入体内促进神经修复的具体机制尚不清楚。有关植入体内后的远期效果报道甚少，有无异位骨化和凋亡等形成。间充质干细胞的分离纯化及扩增等方法还不够完善。移植的时机、移植的数量、移植后存活及长期疗效、移植后能否控制其增殖的速度。有报道称间充质干细胞有肿瘤组织趋向性，但其效果是促进还是抑制肿瘤生长仍有争议。有研究者称间充质干细胞会诱导肿瘤细胞死亡[6]。而有的研究者则称间充质干细胞在肿瘤的转移过程中起着重要作用[26]。细胞移植入体内后的存活率较低且差异较大，介于0.5%～38.0%之间，可能与细胞的种类和植入的时间点有关[27]。目前比较一致的看法是十代以内的细胞基因型基本是稳定的，但随着代数的增多其致瘤风险会增大。有研究表明植入后的细胞活性比在体外培养时要低，因此如何保持和提高细胞活性需进一步研究[28]。干细胞内的微环境由哪些成分组成，这些成分又是如何调节细胞的增值和分化的。植入体内的利与弊如何衡量。体外人工扩增后真正具有功能的间充质干细胞比例是多少。体外培养的细胞活性低，移植前细胞活性的检测对治疗效果影响非常大[29]。目前多采用椎虫蓝染色来检测细胞的活性[30-31]。但还未获得大范围推广。有报道称在体内环境下的培养有利于类施万细胞的增殖，但目前的实验扩增多在体外模拟环境下进行[32]。体外培养的间充质干细胞与血清、细胞因子等直接接触，易受热源和内毒素的污染，有造成医源性感染的风险。

6 小结与展望

只有将间充质干细胞分化诱导、作用的具体机制、分化细胞表型、能否分泌神经递质及量的多少等问题研究清楚后，才能进一步应用于临床[33]。许多组织中间充质干细胞含量较少，因此想在临床上应用必须在体外进行大量的扩增。体外扩增是在人工环境下进行的，扩增后的细胞就可能与从组织中新提取的在生物学方面有所区别，可能会造成医源性的不良反应[34]。间充质干细胞分化需要人工的调控，分化后细胞的纯度值得商榷。衰老是所有有机体的共同特征，干细胞也不例外，因此建立检测衰老的程度和比例的系统和防止或延缓衰老进展非常重要。有研究称体外培养严重影响植入性，植入的细胞最终要被受体自身的细胞所替代[16]。在应用于临床之前，移植的成本、安全性，移植后的有效检测是急需解决的问题[35]。

相信随着生物科学技术的发展，以上提到的问题与不足会逐一解决，间充质干细胞的众多优势定能发挥出来，给人们的未来带来新的希望，周围神经损伤的修复一定会取得突破性进展。

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