两性霉素B联合用药的研究进展

赵柳娅，曹颖瑛，姜远英 (第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)

抗真菌药物联合应用的理论基础主要包括：不同作用机制药物的联合(如多烯类联合三唑类或棘白菌素类抗真菌药物)、不同抗菌谱药物的联合、药物的稳定性和药动学特性。联合用药的可能益处有：提高抗真菌疗效、增加药物的安全性和耐受性以及减少真菌的耐药性[1-5]。当然，联合用药也可能降低药物的抗菌作用而降低疗效，增加药物之间的相互作用及药物不良反应，增加患者的经济负担[6]。近年来，抗真菌药物的联合应用越来越受到人们的关注和重视，有关抗真菌药物联合应用的体内、体外以及临床研究不断增多。现将国内外多烯类药物两性霉素B(amphotericin B，AmB)联合用药的研究进展作一综述。

AmB被称为治疗深部真菌感染的“金标准”，其耐药率最低、抗菌谱广。但是AmB的毒副作用也最为严重，静脉给药时50%～80%的患者会出现发热、发冷、寒战、恶心、呕吐、头痛及肌肉与关节痛，其最主要的毒副作用是不可逆的肾脏毒性，上述毒副作用严重限制了AmB的临床应用[7-9]。因此，寻找一种与其有协同作用的抗真菌药物具有重要意义。

1 AmB与唑类药物合用

两类药物均作用于真菌的同一部位，即AmB通过与真菌细胞膜中固醇的结合发挥作用，改变其渗透性,引起糖、钾离子及氨基酸等内容物外渗,从而抑制真菌的正常生长和代谢,对多种深部和浅部真菌及原虫等有抑杀作用，唑类药物则与细胞色素P450类固醇合成酶结合,抑制该酶的催化活性,从而抑制麦角固醇的生成。有研究者认为，真菌暴露于唑类药物后，细胞膜中麦角固醇会耗竭，AmB的作用部位消失将导致其失去抗菌活性，两者之间表现为拮抗作用。Louie等[10,119]先后通过体外实验发现AmB与氟康唑合用对白念珠菌有拮抗作用。另有研究者认为，AmB与细胞膜结合导致唑类药物更易进入真菌细胞浆而使其抑制麦角固醇的作用增加。主张多烯类可与唑类药物联用者认为，不同唑类药物发挥作用的分子机制存在一定差异。AmB的作用机制包括与固醇之间的生化作用、诱导阳离子渗透及与膜磷脂特别是饱和脂肪酸之间相互作用等，使用唑类药物治疗后并未完全耗竭细胞膜的固醇，AmB可与细胞膜中残存的麦角固醇相结合而发挥其抑制真菌的生长作用。Barchiesi等[12]用棋盘微量稀释法研究发现, AmB分别与伊曲康唑和氟康唑合用时对新生隐球菌主要表现为协同和相加作用,而且未发现有拮抗作用。AmB (或脂质体)与唑类药物(伊曲康唑、氟康唑、酮康唑)合用也可相互增强抗菌活性。虽然体外实验中两种药合用对曲霉有拮抗作用,但Popp等[13]通过对21例侵袭性曲霉病的病例回顾发现, AmB与氟康唑合用的临床治疗中并无拮抗表现,其疗效高于单用AmB治疗组。但是, AmB与唑类药物合用还需要大量随机研究来确定其使用价值。近来国外正在进行氟康唑与AmB合用治疗念珠菌血症的大样本临床试验。

2 AmB与丙烯胺类合用

丙烯胺类抗真菌药能抑制真菌角鲨烯环氧化酶，导致麦角固醇合成减少，角鲨烯堆积又可导致细胞膜破坏，导致细胞死亡。因其抗菌作用与细胞色素P450酶系无关，故不影响人体内分泌功能，肝脏损害极小，与其他药物的相互作用也相当低,丙烯胺类药物包括萘替芬、特比萘芬、布特萘芬等。与唑类药物一样,AmB和丙烯胺类也有可能相互拮抗。但体外实验并未发现作用,而是发现两者有协同和相加作用。在治疗曲霉病、念珠菌病时可以考虑用AmB和特比萘芬联合治疗。Barchiesi等[12]在体外实验中发现,AmB与特比萘芬合用作用于白念珠菌时均有协同和相加作用,而且未发现拮抗作用。Ryder等[14]报道，将特比萘芬与AmB联合应用于烟曲霉和黑曲霉时，有协同和相加作用。

3 AmB与核酸抑制剂合用

核酸抑制剂5-氟胞嘧啶(5-FC)可以选择性地抑制真菌核酸和蛋白质的合成，体内分布广，可透过血-脑屏障(脑脊液中浓度可达血药浓度的60%～90%)，适用于治疗念珠菌属心内膜炎、念珠菌属或隐球菌属所致败血症等。但是，单用本品易致真菌产生耐药性。5-FC在真菌细胞内可转化为5-氟尿嘧啶(5-FU),进一步转化可抑制真菌RNA和DNA的合成,由于它可以穿透血-脑屏障,曾成功地单用5-FC治疗隐球菌脑膜炎和肺部隐球菌病，但人们很快发现单用5-FC容易形成耐药性，故常与其他药物合用。AmB与5-FC的药代动力学不同,两药合用有协同或相加作用，可减少耐药菌株的产生，且联合用药目前尚未出现5-FC耐药的报道。两药联用的临床疗效好，临床应用已有40多年的历史。Rodero等[15]发现AmB和5-FC合用对隐球菌有明显的协同作用。临床资料还显示，联合应用5-FC和AmB治疗隐球菌脑膜炎可以减少第1年的复发率。此外，还发现联合治疗的神经毒性比单用AmB小。将AmB与5-FC联合应用，临床上采取静脉滴注AmB 0.7～1.0 mg/kg + 5-FC 10 mg/kg 2周后，再用氟康唑400 mg/kg巩固治疗[16]。由于AmB和5-FC作用于不同靶点，耐药性问题被明显遏制，两药合用后剂量降低、肾毒性下降。

4 AmB与棘白菌素类合用

棘白菌素又称棘球白素，是一类新型抗真菌药,属于乙酰六环类，为葡聚糖合成酶抑制剂，非竞争性地抑制真菌细胞壁的β-(1,3)-D-葡聚糖的合成而发挥杀菌作用。目前，临床上常用的棘白菌素类抗真菌药物主要有卡泊芬净和米卡芬净。这类药物与AmB合用具有协同作用。AmB通过与真菌细胞膜中固醇的合成发挥作用，而卡泊芬净则抑制真菌细胞壁的β-(1,3)-D-葡聚糖的合成而发挥杀菌作用，这使得两药联用产生协同作用成为可能。Sevtap等[17]发现，AmB和卡泊芬净合用具有协同抗曲霉菌和镰刀菌的作用。对24种临床曲霉和镰刀菌株，将AmB和卡泊芬净单独使用以及联合应用，作用24 h后观察协同指数值(FICI)和完全抑制生长值(MIC-0)，发现超过半数的临床菌株中两药合用具有协同作用。卡泊芬净的MIC-0明显下降，而AmB的MIC-0值轻微下降。Jon等[18]用光滑念珠菌感染免疫抑制小鼠，分别用AmB、卡泊芬净和米卡芬净单独治疗以及采用AmB合用卡泊芬净或米卡芬净治疗。发现单用AmB的治疗效果明显高于空白组并具有剂量依赖性，单用卡泊芬净治疗效果同样明显高于空白组但没有剂量依赖性，而AmB与卡泊芬净或米卡芬净合用能达到单用所不能达到的完全清除感染效果，证明AmB与卡泊芬净或米卡芬净合用能明显提高抗光滑念珠菌的效果。Francesco等[19]发现，AmB和卡泊芬净合用对近平滑念珠菌具有协同作用。通过棋盘稀释法发现，AmB和卡泊芬净合用的MIC90值明显低于两药分别单用值。动物模型中发现，AmB、卡泊芬净合用与单用相比，肾脏中的菌落计数明显降低。采用纸片扩散法研究发现，AmB与卡泊芬净合用的抑菌圈半径大于单用AmB。

5 AmB与天然化合物合用

最近的研究表明，一些本身不是抗真菌或者抗真菌活性很低的化学药和天然产物在与临床常用药物合用后，显现出显著的抗真菌增效作用。大蒜素(allicin)又名大蒜新素，是从百合科葱属植物蒜的鳞茎中提取的一种含硫代亚磺酸酯的化合物，可以增强体内Cu2+活性[20]，而Cu2+通过促进内源性活性氧的生成而产生杀菌活性。蛋白质组学和功能研究结果也表明，AmB与大蒜素合用可以通过增强三羧酸循环和抑制线粒体ATP合酶的活性这两条途径使内源性活性氧大量生成。内源性活性氧的大量生成可导致耐药菌株的氧化损伤，这可能是其协同作用的机制[21]。An等[22]实验表明，大蒜素与AmB合用能与临床分离白念珠菌发挥协同作用；大蒜素能使AmB对白念珠菌的时间-杀菌曲线明显下移；大蒜素能够协同AmB对白念珠菌芽管及菌丝形成的抑制作用。动物体内实验研究发现，与单独应用AmB相比，大蒜素与AmB合用能够显著延长系统性白念珠菌感染的免疫功能低下小鼠的生存时间，并且显著降低肝脏、脾脏、肾脏等主要器官的真菌负荷量。大蒜素是通过多途径、多靶点发挥协同抗真菌作用的，其主要作用机制包括：氧化损伤、抑制麦角固醇生物合成、抑制细胞内ATP产生及产生活性代谢产物等，但是，大蒜素协同抗白念珠菌作用的具体靶点及动物体内的药代动力学，尚有待于进一步研究。

黄芩素(baicalein ,BE)来源于唇形科植物黄芩的干燥根。黄芩作为中草药已经被广泛研究和报道，并且显示出广泛的生物活性，如抗氧化、抗细菌、抗病毒、抗真菌等作用。近年来，多篇文献报道了BE对于微生物的单独药物作用，BE能抑制白念珠菌的凋亡和生物被膜的形成[23,24]。FU等[25]报道了AmB与BE联用促进白念珠菌凋亡伴随着活性氧的增加。AmB能诱导半胱氨酸蛋白酶(caspase)的活性和编码白念株菌caspase(CaMCA1)基因的mRNA表达，当AmB与BE合用时，该效用显著增强。众所周知，AmB能够与真菌细胞膜上的麦角固醇结合, 破坏其结构，导致细胞表面形成许多微孔，膜通透性增加，细胞膜内重要成分外漏而使细胞受损死亡。Phillips 等[26]报道AmB诱导白念株菌凋亡，提示了AmB对于白念株菌可能存在新的抗真菌机制。BE和AmB合用时的细胞凋亡率高于BE或AmB单用。ROS是细胞凋亡的一个重要因素，随后检测到ROS的增加进一步证实了上述结论。据报道，Ras-cAMP-protein kinase A (PKA) 参与了乙酸和氧化应激介导白念株菌细胞凋亡的过程。敲除Ras-cAMP-PKA的突变菌株中，凋亡的应答被抑制，而在被激活的Ras-cAMP-PKA的突变菌株中，其信号的上调使得凋亡过程加速[27]。CaMCA1是一种类似于酿酒酵母中YCA1的因子，与过氧化氢诱导的白念株菌凋亡有关[28]。但是，AmB诱导白念株菌凋亡的主要原因目前尚不清楚。单用AmB能明显增加caspase活性，而BE和AmB合用具有更高的caspase活性。RT-PCR结果表明，CaMCA1的RNA表达量在单用AmB和联用BE、AmB中都增加。用CaMCA1敲除突变菌株进行细胞凋亡检测，发现CaMCA1的敲除明显减弱了AmB诱导的凋亡作用和caspase活性。以上结果表明，CaMCA1介导caspase通路并与AmB诱导的白念株菌凋亡相关。值得注意的是，由BE诱导的白念株菌凋亡与CaMCA1介导的caspase通路不相关，因为单用BE没有发现显著的caspase活性的变化以及CaMCA1表达的变化。但是，当BE和AmB合用，CaMCA1介导的caspase通路是高表达的，说明CaMCA1介导的caspase通路与BE和AmB的合用具有相关性[25]。

6 三种药物合用

动物实验证实，AmB、氟胞嘧啶和氟康唑联用对小鼠隐球菌脑膜炎有显著疗效。Clancy等[29]报道用AmB、5-FC和伊曲康唑合用治愈1例骨髓移植患者的皮下暗色丝孢霉病。还有学者采用多烯类药物、唑类药物和5-FC合用治疗42例AIDS患者并发隐球菌脑膜炎,感染得到控制的成功率超过90%。从理论上讲,如果三种药物其两两相互之间是协同或相加作用则三药合用会增强抗菌活性,但随之而来的是其毒副作用也可能增多。目前,临床上应用较多的是AmB、5-FC和一种唑类药物(氟康唑或伊曲康唑)合用治疗隐球菌病,故两药或多药联用时应加强对肝、肾功能和血象的观察及检查。

7 其他联合用药

将抗真菌药与细胞因子或单克隆抗体合用治疗真菌病也有良好的应用前景,Ellis等[30]用大剂量AmB脂质体和IFN-γ成功治愈1例颅内曲霉感染,避免了手术治疗。

8 结语

新型抗真菌药物的不断出现为抗真菌药物的联合应用奠定了基础，各种可能的有效药物组合也逐渐开始应用于临床，不仅可加强疗效、减少单种药物剂量，还可减轻药物的毒副作用。

综上所述,抗真菌药AmB的联合应用研究近年来取得了较大进展,很多联合用药已进入临床应用阶段,但药敏试验结果与临床疗效的相关性目前尚无满意结论。有学者认为,在动物体内实验和体外实验中表现出的药物相互作用并不一定会表现在患者身上,同样的药物对不同的患者疗效也会不同。因为影响药物疗效的因素有很多,如患者的体质特性、免疫状况、病原菌在体内的代谢改变、药物在感染部位的渗透性强弱等。因此,对于联合用药还需要进行大样本的临床研究，以总结出安全可靠的用药方案，同时用药应遵循个体化原则。

【参考文献】

[1] Montoya JG,Rosso F. Is combination therapy indicated for invasive fungal infections?Yes and no[J].Curr Opin Infect Dis,2006,19(4):371-379.

[2] Nivoix Y,Zamfir A,Lutun P,etal,Combination of caspofungin and an azole or an amphotericin B formulation in invasive fungal infections[J].J Infect,2006,52(1):67-74.

[3] Kontoyiannis DP,Lewis RE.Combination chemotherapy for invasive fungal infections:what laboratory and clinical studies tell us so far[J].Drug Resist Updat,2003,6(1):257-269.

[4] Mukherjee PK,Sheehan DJ,Hitchcock CA,etal.Combination treatment of invasive fungal infections[J].Clin Microbiol Rev,2005,18(1):163-194.

[5] Chamilos G,Kontoyiannis DP.The rationale of combination antifungal therapy in severely immuncompromised patients:empiricism versus evidence-based medicine[J].Curr Opin Infect Dis,2006,19(4):380-385.

[6] Marr KA,Boeckh M,Carter RA,etal.Combination antifungal therapy for invasive aspergillosis[J].Clin Infect Dis,2004,39(6):797-802.

[7] Matsuoka S, Murata M. Cholesterol markedly reduces ion permeability induced by membrane-bound amphotericin B[J]. Biochim BiophysActa, 2002,1564(2):429-434.

[8] Fanos V, Cataldi L. Amphotericin B-induced nephrotoxicity: a review[J]. J Chemother, 2000,12(6):463-470.

[9] Mayer J, Doubek M, Doubek J,etal. Reduced nephrotoxicity of conventional amphotericin B therapy after minimal nephroprotective measures: animal experiments and clinical study[J]. J Infect Dis 2002,186(3):379-388.

[10] Louie A, Kaw P, Banerjee P,etal. Impact of the order of initiation of fluconazole and amphotericin B in sequential or combination therapy on killing of Candida albicansinvitroand in a rabbit model of endocarditis and pyelonephritis[J].Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(2):485-494.

[11] Samaranayake YH, Samaranayake LP, Yeung KW. Evaluation of polyene-azole antagonism in liquid cultures ofCandidaalbicansusing an automated turbidometric method[J].Chemotherapy, 2001, 47(4):279-291.

[12] Barchiesi F, Schimizzi AM, Caselli F,etal. Interactions between triazoles and amphotericin B againstCryptococcusneoformans[J].Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44(9):2435-2441.

[13] Popp AI, White MH, Quadri T,etal. Amphotericin B with and without itraconazole for invasive aspergillosis. A three-year retrospective study[J].Int J Infect Dis, 1999, 3(3):157-160.

[14] Ryder NS, Leitner I. Synergistic interaction of terbinafine with triazoles or amphotericin B againstAspergillusspecies[J].MedMycol, 2001, 39(1):91-95.

[15] Rodero L, Cordoba S, Cahn, P,etal.Invitrosusceptibility studies of Cryptococcus Neoformans isolated from patients with no clinical response to amphotericin B therapy[J].J Antimicrob Chemother,2000, 45(2):239-242.

[16] Perfect JR, Dismukes WE, Dromer F,etal. Clinical practice guidelines for the management of cryptococcal disease: 2010 update by the infectious diseases society of america[J]. Clin Infect Dis, 2010,50(3):291-322.

[17] Sevtap Arikan, Mario Lozano-Chiu,Victor Paetznick,etal.Invitrosynergy of caspofungin and amphotericin BAgainstAspergillusandFusariumspp[J].Antimicrob Agents Chemother,2002, 46(1):245-247.

[18] Jon AO, Adler-Moore JP, Smith PJ,etal. Treatment of Candida glabrata infection in immunosuppressed mice by using a combination of liposomal amphotericin B with caspofungin or micafungin[J]. Antimicrob Agents Chemother,2005, 49 (12):4895-4902.

[19] Francesco B,Elisabetta S,Serena T,etal.Caspofungin in combination with amphotericin B againstCandidaparapsilosis[J]. Antimicrob Agents Chemoth, 2007, 51(3):941-945.

[20] Ogita A, Hirooka K, Yamamoto Y,etal. Synergistic fungicidal activity of Cu2+and allicin, an allyl sulfur compound from garlic, and its relation to the role of alkyl hydroperoxide reductase 1 as a cell surface defense inSaccharomycescerevisiae[J]. Toxicology,2005,215(3):205-13.

[21] Xu Y, Wang Y, Yan L,etal. Proteomic analysis reveals a synergistic mechanism of fluconazole and berberine against fluconazole-resistantCandidaalbicans: endogenous ROS augmentation[J]. J Proteome Res,2009,8(11):5296-304.

[22] An M, Shen H, Cao Y,etal.Allicin enhances the oxidative damage effect of amphotericin B againstCandidaalbicans[J]. Int J Antimicrob Agents. 2009; 33(3):258-63.

[23] Cao YY,Dai BD, Wang Y,etal.In vitro activity of baicalein againstCandidaalbicansbiofilms[J]. Int J Antimicrob Agents, 2008,32:73-77.

[24] Huang S, Cao YY, Dai BD,etal. In vitro synergism of fluconazole and baicalein against clinical isolates ofCandidaalbicansresistant to fluconazole.Biol PharmBull, 2011,31:2234-2236.

[25] Fu ZJ, Lu H,Zhu ZY,etal.Combination of baicalein and amphotericin B acceleratesCandidaalbicansapoptosis[J].Biol PharmBull,2011,34(2) :214-218.

[26] Phillips AJ, Sudbery I, Ramsdale M.Apoptosis induced by environmental stresses and amphotericin B inCandidaalbicans[J]. Proc Natl Acad Sci,2003,100:14327-14332.

[27] Phillips AJ, Crowe JD, Ramsdale M.Ras pathway signaling accelerates programmed cell death in the pathogenic fungusCandidaalbicans[J]．Proc Natl Acad Sci,2006,103:726-731.

[28] Cao YY,HuangS, Dai BD,etal.Candidaalbicanscells lacking CaMCA1-encoded metacaspase show resistance to oxidative stress-induced death and change in energy metabolism[J].Fungal Genet Biol,2009,46:183-189.

[29] Clancy CJ, Wingard JR, Hong-Nguyen M. Subcutaneous phaeohyphomycosis in transplant recipients: review of the literature and demonstration of invitro synergy between antifungal agents[J].Med Mycol, 2000, 38(2):169-175.

[30] Ellis M, Watson R, McNabb A,etal. Massive intracerebral aspergillosis responding to combination high dose liposomal amphotericin B and cytokine therapy without surgery[J].J Med Microbiol,2002, 51(1):70-75.