吖啶类荧光探针用于微量蛋白质测定的研究

张丽娟，吴文强

（1.福建生物工程职业技术学院药学系，福建福州350002；2.福建广生堂药业股份有限公司，福建福州350003）

吖啶类荧光探针用于微量蛋白质测定的研究

张丽娟1，吴文强2

（1.福建生物工程职业技术学院药学系，福建福州350002；2.福建广生堂药业股份有限公司，福建福州350003）

目的：利用合成的3种新型的蛋白质分子荧光探针N-（2-二甲氨基）乙基-9-氯吖啶-4-甲酰胺（NCAF）、9-[（N-2-二甲氨乙基）吖啶-4-甲酰胺]-α-丙氨酸（NAFA）和4,9-二[N-（2-二甲氨基）乙基] -9-吖啶胺-4-甲酰胺（DNAF）结合荧光发射光谱，建立了3种新的微量蛋白质测定方法。方法：通过建立适宜的NCAF-SDS（十二烷基硫酸钠）、NAFA-SDS和DNAF-SDS荧光猝灭体系，牛血清白蛋白（BSA）的加入对体系的荧光具有恢复作用，并随着BSA加入浓度的增大，荧光恢复程度逐渐增强，并在一定的浓度范围内呈线性关系，由此建立了用新型吖啶类荧光探针测定BSA的荧光分析新方法。结果：从NCAF、NAFA到DNAF测定线性范围分别为5.0×10-9～6.8×10-7，9.0×10-9～8.2×10-8和5.0×10-9～8.3×10-7mol·L-1；测定灵敏度（3σ/K）分别为1.1×10-10，3.8×10-10和1.0×10-10mol·L-1。结论：该测定方法具有良好的荧光响应和稳定性，为微量蛋白质定量分析提供了新的技术体系。

吖啶类荧光探针；蛋白质定量分析；荧光分析法

荧光染料探针法测定蛋白质方法简便、灵敏度高，在蛋白质杂交研究、疾病诊断和食品安全检测等方面有广阔应用前景，已成为蛋白质检测的重要手段。研究表明，荧光染料在表面活性剂的存在下可自聚为二聚体，二聚体结构随蛋白质的加入而逐渐解聚，导致荧光强度发生变化，这种能自聚反应的染料可作为蛋白质测定的荧光探针[1]。以下是3种新合成的吖啶类荧光染料探针，以4-羧基吖啶酮为母体，在4位上引入N-（2-二甲氨基）乙基，合成了N-（2-二甲氨基）乙基-9-氯吖啶-4-甲酰胺（NCAF），具有3个平面六元环共轭结构，结构简单，可进入血清白蛋白分子内疏水空腔，通过疏水作用力与血清白蛋白分子紧密结合，也可通过氢键及静电吸引力与血清白蛋白表面结合。在此基础上，通过在9位上引入支链α-丙氨酸，合成了9-[（N-2-二甲氨乙基）吖啶-4-甲酰胺]-α-丙氨酸（NAFA），大大改善了吖啶类化合物与生物大分子的亲和性，使其极易与蛋白质分子形成氢键，使得荧光量子效率有较大提高[2]。通过在9位上引入N-（2-二甲氨基）乙基，合成了4,9-二[N-（2-二甲氨基）乙基]-9-吖啶胺-4-甲酰胺（DNAF），提高了荧光量子产率，强化分子正电性，且不受体系酸度影响[3]。

新型的吖啶类荧光探针在适量的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）存在下形成二聚体，自聚平衡随着蛋白质的加入而被破坏，在一定的浓度范围荧光明显增强。本文利用在一定浓度表面活性剂存在下生成的二聚体作为荧光探针，建立了一种微量蛋白质定量分析新方法，找出以该体系测定蛋白质的最佳条件，并在该条件下测定蛋白质。

1 仪器与试剂

Varian Cary Eclipse荧光光谱仪（美国VARIAN）；PHS-3C型酸度计（上海大普仪器有限公司）。

NCAF由实验室自制，配成3.0×10-4mol·L-1的储备液（水∶CH2Cl2∶CH3OH=98∶1∶1），4℃条件下避光保存；NAFA由实验室自制，配成1.0× 10-5mol·L-1储备液，4℃条件下避光保存；DNAF由实验室自制，配成3.0×10-4mol·L-1储备液，4℃条件下避光保存；牛血清白蛋白（BSA）（Sanland-chem Internation Inc.）配成含0.1mol·L-1NaCl的1.0× 10-5mol·L-1储备液，保存于4℃避光条件下；十二烷基硫酸钠（SDS）（国药集团化学试剂有限公司）配成1.0×10-2mol·L-1储备液；Tris-HCl缓冲溶液（pH7. 0）；所用试剂均为生化纯与分析纯，实验用水均为二次去离子水。

2 BSA测定分析

2.1 最优条件选定

实验考察优化了荧光探针浓度、表面活性剂浓度、缓冲液pH值、温度的影响。在Tris-HCl缓冲溶液pH值为7.0，温度15℃，NCAF的浓度为1.0× 10-5mol·L-1，SDS的浓度为1.2×10-3mol·L-1情况下，体系具有最大二聚体比例，加入BSA后，NCAF -SDS体系具有最大荧光强度回升。在McIlvaine缓冲溶液pH值为5.0，温度15℃，NAFA的浓度为1.0× 10-6mol·L-1，SDS的浓度为4.0×10-4mol·L-1情况下，体系具有最大二聚体比例，加入BSA后，NAFA -SDS体系具有最大荧光强度回升。在Tris-HCl缓冲溶液pH值为7.0，温度15℃，DNAF的浓度为1.0× 10-5mol·L-1，SDS的浓度为1.2×10-3mol·L-1，情况下，体系具有最大二聚体比例，加入BSA后，DNAF -SDS体系具有最大荧光强度回升[4]。

2.2 实验方法

在一系列5mL刻度试管中加入pH值为7.0 Tris-HCl缓冲溶液2.0 mL，一定体积NCAF（3.0× 10-4mol·L-1）溶液及SDS溶液（1.0×10-2mol·L-1），使NCAF浓度为1.0×10-5mol·L-1，SDS浓度为1.2× 10-3mol·L-1，在15℃下稳定30min后加入不同体积BSA（1.0×10-5mol·L-1）溶液，用水稀释至刻度，摇匀，在15℃下稳定30min后测定工作曲线，激发波长254nm，发射波长400～600nm，狭缝宽度均为5nm。NAFA和DNAF分别用上述同样方法测定工作曲线。

2.3 线性范围和检出限的测定

2.3.1 NCAF线性范围和检出限的测定蛋白质为两性分子，在pH值大于9.8的溶液中，主要存在形式为NH2-Pr-COO-，在pH值小于4.36的溶液中，主要存在形式为在pH值为5.0的NCAF-SDS体系中时，大部分蛋白质呈质子化，可与NCAF-SDS离子缔合物的SDS发生结合作用。BSA的加入破坏了NCAF-SDS离子缔合物形成的微环境，使游离单体浓度增强，体系荧光强度回升。随BSA加入，体系荧光峰明显回升。在最佳实验条件下，利用NCAF-SDS体系用于BSA的测定，NCAF在455nm处荧光强度的增加△F与BSA浓度在一定范围内呈线性关系（见图1）。工作曲线的线性回归方程为y=4.2584χ+8.654，线性范围5.0× 10-9～6.8×10-7mol·L-1，相关系数R=0.9936，检出限为1.1×10-10mol·L-1，对25.0μg·mL-1BSA进行8次测定，相对标准偏差为4.11%。

（a）NCAF-SDS体系测定微量BSA的荧光光谱

图1 NCAF-SDS体系测定微量BSA的荧光光谱图及工作曲线Fig.1（A）The fluorescence emission spectra of interaction between SDS and NCAF and BSA in aqueous solution.（B）Calibration curve for low concentration of BSA.

2.3.2 NAFA线性范围和检出限的测定在最佳实验条件下，以在SDS作用下形成的NACA二聚体体系用于BSA的测定，NACA在447nm处荧光强度的增加△F与BSA浓度在一定范围内呈线性关系（见图2）。工作曲线的线性回归方程为y=19. 334χ+7.9087，线性范围9.0×10-9～8.2×10-8mol· L-1，相关系数R=0.9993，检出限为3.8×10-10mol·L-1，对3.0μg·mL-1BSA进行8次测定，平均值3.03μg· mL-1，相对标准偏差为2.78%。

图2 NAFA-SDS体系测定微量BSA的荧光光谱图及工作曲线Fig.2（A）The fluorescence emission spectra of interaction between SDS and NAFA and BSA in aqueous solution.（B）Calibration curve for low concentration of BSA.

2.3.3 DNAF线性范围和检出限的测定在最佳实验条件下，将DNAF-SDS离子缔合物体系用于微量BSA的测定，该体系在451nm处的荧光强度随BSA浓度的加大而增强，其荧光增加值△F与BSA浓度在一定范围内呈线性关系（见图3）。工作曲线的线性回归方程为y=1.5982χ-0.5244，线性范围5.0×10-9～8.3×10-7mol·L-1，相关系数R=0.9984，检出限为1.0×10-10mol·L-1，对25.0μg·mL-1BSA进行8次测定，平均值26.3μg·mL-1，相对标准偏差为3.87%[4]。

图3 DNAF-SDS体系测定微量BSA的荧光光谱图及工作曲线Fig.3（A）The fluorescence emission spectra of interaction between SDS and DNAF and BSA in aqueous solution.（B）Calibration curve for low concentration of BSA

2.3.4 NCAF、NAFA、DNAF三者测定蛋白质效果的比较表1为3种染料探针测定BSA的效果比较。

表1 NCAF，NAFA，DNAF测定BSA的效果比较Tab.1Effect of determination for BSA by using NCAF and NAFA and DNAF

由表1可知，DNAF与BSA的相互作用最弱，但测定线性范围和灵敏度均最佳。这说明3种染料探针应用于蛋白质测定的效果与探针和BSA间的相互作用机制没有必然关系，该系列吖啶-4-酰胺衍生物用于蛋白质测定的原理并非基于染料与蛋白质的直接作用，而是通过蛋白质对于染料-SDS体系微环境的改变作用，使得染料与SDS离子缔合物发生解聚，以及使染料单体、二聚体的形态发生转化，促使体系荧光强度回升，达到测定微量蛋白质的目的。

3 结论

利用3种吖啶-4-酰胺化合物为探针，结合荧光发射光谱，建立了3种新的蛋白质测定方法，具有较低的检测限，良好的荧光响应和稳定性，为蛋白质定量分析提供了新的技术体系。测定的效果与染料结构关系密切。从提高该系列荧光探针荧光量子产率的角度考虑，4,9位上的取代基，特别是9位，应当尽量选择-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR， -CN等给电子取代基，这有利于提高吖啶-4-酰胺衍生物探针的荧光，而应避免连接羰基、羧基、硝基和重氮类基团。从提高该系列探针用于测定蛋白质的效果角度考虑，应尽量减弱其于蛋白质的相互作用，以避免染料与蛋白质相互结合对体系荧光的猝灭作用。NCAF的结构设计上，由于9位缺乏有活性的侧链基团，其荧光量子产率和水溶性均不佳，且与BSA作用强烈，但其在微量蛋白质实际测定方面仍具有不错的效果，可以作为一种有前途的蛋白质荧光探针。而NAFA在结构设计上，9位引入酸碱基团?-丙氨酸，使得染料与蛋白质的结合特性可以受到体系酸度的调节，对于部分特殊酸碱性质的蛋白质测定具有一定的应用意义。DNAF的设计上，9位引入又一个N-（2-二甲氨基）乙基基团，提高了染料的水溶性和荧光效率，并利用分子间的电荷排斥力以及较大的空间位阻，减弱了其与BSA的相互作用，提高了性能，在微量蛋白质测定中获得了良好的效果。

［1］陈鸿琪,夏闽.荧光染料吖啶红测定蛋白质的生物探针［J］.理化检验（化学分册）,2001,37（2）:53-55.

［2］宋化灿,季风英,宋继国,等.吖啶类衍生物的荧光性质［J］.分析测试学报,2005,24:39-41.

［3］张丽娟.吖啶-4-甲酰胺衍生物的合成与表征［J］.广州化工, 2011,39（15）:117-118.

［4］张丽娟.用4,9-二［N-（2-二甲氨基）乙基］-9-吖啶胺-4-甲酰胺测定微量蛋白质［J］.安徽工业大学学报（自然科学版），2011，28（4）:380-383.

［5］冯喜兰,赵永和,田孟魁,等.利用有机小分子测定蛋白质反应的研究［J］.河南科技学院学报（自然科学版）,2005,33（2）:75-77.

Research into the application of acridine fluorescence probes to trace protein measurement

ZHANG Li-juan1，WU Wen-qiang2
（1.Department of Pharmacy，Fujian Vocational and Technical Institute of Biological Engineering，Fuzhou 350002，China；2.Fujian Cosunter Pharmaceutical Co.,Ltd.，Fuzhou 350003，China）

Objective:To establish three new ways to measure trace protein by utilizing 3 new synthetized types of protein molecule fluorescence probes,namely,NCAF,NAFA and DNAF and by combining with fluorescence emission spectrum.Method:First establish a proper fluorescence quenching system of NCAF-sodium dodecyl sulfate（SDS）,NAFA-SDS and DNAF-SDS,then add bovine serum albumin（BSA）to help restore the fluorescence of the system,and the higher the concentration of BSA added,the more the fluorescence is restored with linear relationship exhibited within certain concentration range,and thus we have established a new fluorescence analysis method of measuring BSA with new types of acridine fluorescence probes.Result:The effects of NCAF、NAFA and DNAF are good with the measured linear range of 5.0×10-9～6.8×10-7，9.0×10-9～8.2×10-8and 5.0×10-9·8.3×10-7mol·L-1respectively and the measurement sensitivity（3σ/K）of 1.1×10-10，3.8×10-10and 1.0×10-10mol·L-1respectively.Conclusion:The said measuring method boasts good fluorescence response and stability,and thus offers a new technical system for the quantitative analysis of trace protein.

acridine fluorescence probes；quantitative protein analysis；fluorescence analysis method

O657

A

1002-1124（2014）11-0023-04

2014-08-26

张丽娟（1977-），女，福建福州市人，讲师，从事化学教学和研究工作。