micro-CT法观测雌性小鼠股骨骨参数的分析

耿 沁， 朱淼鑫， 孙 磊， 崔永奇， 孔韩卫， 姚 明， 刘 蕾

(上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室, 上海 200032)

micro-CT法观测雌性小鼠股骨骨参数的分析

耿 沁， 朱淼鑫， 孙 磊， 崔永奇， 孔韩卫， 姚 明， 刘 蕾

(上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室, 上海 200032)

目的 利用小动物CT(micro-CT)收集正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠与BALB/c小鼠股骨的影像学数据。方法 BALB/c-nu/nu小鼠与BALB/c小鼠各15只，雌性，10～12周龄，取股骨后用micro-CT进行扫描，将得到的数据进行系统分析。结果 成功收集了正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠与BALB/c小鼠股骨的CT影像学数据。通过数据分析，发现两者在皮质骨相对骨体积上具有显著差异,在骨小梁相对骨体积、骨表面积与组织体积比值和骨密度也有显著差异。结论 micro-CT可以对雌性小鼠股骨的各项参数进行定量分析。

micro-CT; 股骨; 小鼠; 雌性

随着全球人口老龄化, 骨质疏松已成为挑战人类健康、威胁老年人生活的主要疾病之一[1], 其中女性的发病率是男性的3～5倍。小鼠是生命科学研究和医学研究的重要模式生物, 文献表明, 已有不少小鼠模型广泛应用于骨质疏松研究的各个方面[2～4]。

以往的骨结构研究主要是将骨组织进行切片，从而得到扫描图像，通过数学模型的建立以计算骨的各项指标[5]。目前，小动物CT(m icro computed tomography，微计算机断层扫描技术)的应用不仅可以在活体上研究骨的微结构，更能够进行骨骼图像的三位重建，还可以定量分析骨的各项参数。正是基于micro-CT在骨分析中的优势，该技术广泛应用于骨质疏松等的药物开发及临床前研究[6,7]。

对于骨质疏松的诊断，需要正常群体的骨参数，但目前尚未找到小鼠骨参数正常值的报道。股骨是骨质疏松导致病理性骨折的高发部位[8], 而女性又是骨质疏松高发病人群，因此本研究以雌性小鼠股骨为研究对象，使用micro-CT分析了股骨的皮质骨和骨小梁各项指标，探讨建立相应的操作方法及收集正常雌性小鼠股骨数据，为小鼠骨质疏松模型的研究提供可参考的正常股骨数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雌性BALB/c小鼠15只, 10～12周龄(体质量22～24 g); SPF级雌性BALB/c-nu/nu小鼠15只，10～12周龄(体质量20～22 g), 均由上海市肿瘤研究所提供[SCXK(沪)2012-0001]，实验操作及动物饲养严格按照SPF级标准要求进行[SYXK (沪) 2012-0001]。

1.1.2 仪器 比利时产小动物micro-CT成像系统，型号: SkyScan 1076。

1.2 方法

BALB/c-nu/nu小鼠与BALB/c小鼠各15只, 麻醉处死后切取股骨固定于无水乙醇中。然后用小动物micro-CT进行扫描, 扫描条件为: 电压 (kV): 40, 电流 (μm): 250, 虑片: 无, 分辨率 (μm): 18.26017, 步长(deg): 0.6000。扫描后将得到的数据进行处理分析。骨分析参数所表示的意义，TV: 选取ROI体积; BV: 骨体积; BV/TV: 相对骨体积; TS: 选取ROI面积; BS: 骨表面积; BS/BV: 骨表面积和骨体积的比值; BMD: 骨密度; BS/TV: 骨表面积和组织体积的比值。

1.3 统计分析

利用SPSS 21.0软件进行统计分析，计算均值和标准差，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 小鼠股骨不同角度平扫图

2 结果

使用micro-CT对小鼠股骨进行扫描并三维重建, 对骨结构的各项参数进行分析。

2.1 股骨扫描图片

取小鼠股骨，经m icro-CT扫描并三维重构，BALB/c-nu/nu小鼠和BALB/c小鼠扫描图片无明显差别(图1、图2), 其中, 三维重构图为股骨头曲近至远的冠状截面图。

图2 小鼠股骨三维重构后不同位置的冠状面图

表1 雌性BABL/c-nu/nu小鼠与BALB/c小鼠股骨扫描结果及比较

2.2 股骨扫描结果及比较

皮质骨中，雌性BABL/c-nu/nu小鼠与BALB/c小鼠在相对骨体积上具有显著差异。骨小梁中, 雌性裸小鼠与BALB/c小鼠在相对骨体积、骨表面积与组织体积比值和骨密度具有显著差异(图2, 表1)。

3 讨论

micro-CT技术是近年来发展起来的一项对小动物活体研究最重要的工具之一[9]。它与普通临床CT最大的差别在于分辨率极高, 可以达到微米(μm)级别，能区分体内各种组织的密度并对其作定量测定; 同时由于其能消除前后组织的重叠, 从而可以清楚地进行形态结构的造影，显示动物解剖结构和生理功能。目前，m icro-CT技术在很大程度上取代了破坏性的组织形态计量学方法。随着各种疾病动物模型的建立，对动物模型的诊断、治疗的评估也显得越来越重要，其中在各类创伤及疾病引起的骨性病理性损伤也越来越受到人们的重视[10]。

micro-CT在生物医学的应用领域主要有骨研究(如骨小梁)、牙齿及牙周组织研究、生物材料(如仿生材料生物支架的孔隙率、强度等)、疾病机制研究(如疾病状态对骨骼发育、修复的影响)、新药开发(如骨质疏松症及疗效评价), 主要是对活体小动物、硬组织和相关软组织的扫描成像分析，集中于骨领域研究[11], 这主要源于骨骼和空气及周围软组织之间良好的对比性。micro-CT能够在不损毁样品的情况下, 对活体小动物、骨骼、牙齿和各种生物材料进行高分辨率X射线成像。其中, 骨骼是micro-CT最主要的应用领域之一[12～15], 而骨小梁又是主要研究对象[16], 此外数据分析软件中包括多达16项(如BMC、TMD、BV、Yb.N、Tb.Th等)的骨参数分析。

micro-CT在实验动物或者小型标本的骨结构分析上具有一定的优势, 并且可以一次扫描同时测量骨密度及骨微结构, 在三维重建模型上得到的骨结构数据更精确。传统体视学方法研究只能提供某个切面的二维图像, 而m icro-CT可以直接显示三维结构图。m icro-CT还可以在三维结构中直接测得各种数据, 而体视学方法必须以平板模型为基础进行模拟计算, 显然micro-CT的数据更为精准。根据实验动物使用的替代(replacement)、 减少(reduction)和优化(refinement)(“3R”原则)[17], 实验中需尽量减少实验动物的使用, 无疑micro-CT在骨研究中的应用符合这一要求。

对于骨质疏松的诊断，需要获得正常群体的骨参数，其中由于股骨是骨质疏松引发骨折的高发部位，而且女性的发病率明显高于男性，因此作者选取了正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠和BALB/c小鼠的股骨为观测对象，使用micro-CT分析股骨的皮质骨和骨小梁各项指标，由此不仅获得了正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠和BALB/c小鼠股骨的三维成像图，而且通过软件分析获得了皮质骨和骨小梁的相关骨参数。同时, 对同周龄同性别BALB/c-nu/nu小鼠和BALB/c小鼠的股骨数据进行比较，发现BALB/c小鼠的股骨密度明显高于BALB/c-nu/nu小鼠，而皮质骨中BALB/c-nu/nu小鼠的相对骨体积显著高于BALB/c小鼠，在骨小梁中则正好相反。

m icro-CT通过扫描所得的二维、三维图像观察到骨结构形态，以及骨小梁的数量、结构、形态的变化情况，能够对实验样品进行直观的观察和分析，骨分析也大大节省了实验时间，却能获得全面的骨参数。因此，m icro-CT在骨科研究中的应用具有优势，因为它引入了新的实验方法。总之，本次研究获得了正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠和BALB/c小鼠股骨的影像学数据，完善了操作条件及方法，为小鼠骨相关研究提供了参考数据。

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Analysis on Femur Bone Parameters in Female Mice by Using Micro-CT

GENG Qin, ZHU M iao-xin, SUN Lei, CUI Yong-qi, KONG Han-wei, YAO M ing, LIU Lei
(Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes of Shanghai Cancer Institute, Shanghai 200032, China)

ObjectiveTo obtain femur bone datas about female BALB/c-nu/nu and BALB/c mice by using micro-CT.MethodsThe femur from fifteen female nude mice w ith BALB/c background and BALB/c mice respectively, aged 10-12weeks, were scanned w ith micro-CT.ResultsThe parameters of female BALB/c-nu/nu and BALB/c mice femur bone were detected by using micro-CT, there are differences of femur bone in some parameters between BALB/c-nu/nu and BALB/c mice. In the vortical bone, there is significant difference in BV/TV. In the trabecular bone, BV/TV, BS/TV and BMD have significant difference.ConclusionsM icro-CT can be used for quantitative analysis of mice femur bone parameters.

M icro-CT; Femur; Mice; Female

Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0046-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.009

2013-08-08

上海市科委创新行动计划(11140902100)

耿 沁(1974-), 男, 主管技师, 研究方向: 小动物影像学技术在动物模型中的应用, E-mail: gq888899@163.com

刘 蕾, E-mail: leilei_liu@126.com