普鲁兰酶的分离纯化及部分酶学性质

周念波

（武汉生物工程学院生物工程系，湖北武汉430415）

普鲁兰酶的分离纯化及部分酶学性质

周念波*

（武汉生物工程学院生物工程系，湖北武汉430415）

对盐球菌（Halococcus sp.）Z1、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）所产的普鲁兰酶粗酶液的耐热耐酸性进行了比较研究，并采用（NH4）2SO4盐析、透析、DEAE-Sephadex A25阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤对Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶进行分离纯化，并测定了其部分酶学性质。结果表明Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶在低于65℃和pH4.0～7.5范围内有很好的稳定性，最适反应温度为60℃，最适反应pH为5.0～5.4，相对分子质量为8.17×104，Km值为0.24 mg/mL。

普鲁兰酶；纯化；性质

普鲁兰酶（Pullulanase，EC 3.2.1.41）是能够专一性地作用于普鲁兰糖、支链淀粉、糖原及相应低聚糖中的α-1，6-糖苷键，从而切下整个侧枝的一种脱支酶，已广泛应用于以淀粉为原料的各种工业生产中。

文献报道过的普鲁兰酶有多种，在应用方面近年来主要以开发耐热耐酸普鲁兰酶为主。本试验以实验室筛选所得的盐球菌（Halococcus sp.）Z1、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的发酵粗酶液为研究对象，探讨其在热稳定性和酸碱稳定性方面的性质，对其中符合耐热耐酸特性的普鲁兰酶，进一步进行分离纯化和其他方面酶学性质的研究。

1 材料与方法

1.1 试剂

普鲁兰糖，纯度99%，上海普奥生物科技有限公司；DEAE-Sephadex A25，上海楷洋生物技术有限公司；Sephadex G-100，南京都莱生物技术有限公司；低分子量标准蛋白质，相对分子量1.44×104～9.74×104，大连宝生物工程有限公司。

1.2 菌种及培养基

盐球菌（Halococcus sp.）Z1、解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），武汉生物工程学院酶工程实验室自筛。

产酶发酵培养基：每100 g培养基中添加糯米淀粉2.5 g，蛋白胨1 g，（NH4）2SO40.25 g，MgSO4· 7H2O 0.05 g，FeSO40.001 g，KH2PO40.1 g，pH5.0。

摇瓶产酶条件：35℃，160 r/min，摇瓶培养48 h。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制备

摇瓶培养后，收集发酵液，5 000 r/min低温离心后取上清液，制得粗酶液。

1.3.2 蛋白质浓度测定

蛋白质浓度测定采用Folin-酚试剂法（Lowry法）。

1.3.3 酶活测定

酶活测定参照参考文献[7]。

1.3.4 硫酸铵分级沉淀

向粗酶液中缓慢加入（NH4）2SO4至25%饱和度，4℃静置过夜后7 500 r/min冷冻离心，弃去沉淀。在清液中继续加入（NH4）2SO4，使其饱和度达到75%，4℃静置过夜后7 500 r/min冷冻离心，将沉淀溶于0.02 mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液，置于透析袋中，用0.02 mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液透析24 h。

1.3.5 DEAE-SephadexA25离子交换层析

将透析后的酶液上样至已平衡好的层析柱（2 cm×15 cm），用0.02 mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液（内含0.0 mol/L～0.5 mol/L的NaCl）进行梯度洗脱，控制流速为0.5 mL/min，每管5.0 mL收集，测定酶活，合并酶活较高的部分，用PEG20000进行浓缩。

1.3.6 SephadexG-100凝胶过滤层析

上步浓缩后的酶液上样至已用0.02 mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡的层析柱（1.5 cm×50 cm），用相同缓冲液进行洗脱，控制流速为0.2 mL/min，每3.0 mL收集一管，测定各管酶活，合并酶活较高的部分，用PEG20000进行浓缩。

1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用不连续垂直平板电泳系统，对纯化后的普鲁兰酶进行SDS-PAGE纯度分析。浓缩胶和分离胶质量浓度分别为3%和15%，考马斯亮蓝R-250染色。

2 结果与分析

2.1 温度对普鲁兰酶活性及稳定性的影响

分别于不同温度下测定普鲁兰酶活力，以活力最高者为100%对照，试验温度对3种菌株所产普鲁兰酶活力的影响，结果见图1。由图1可知，菌株Halococcus sp.Z1所产酶在低于60℃范围内，酶活随温度升高而升高，当温度超过60℃后，酶活逐渐下降；菌株Bacillus amyloliquefaciens所产酶在60℃～70℃范围内酶活较高，65℃时酶活最高；菌株Bacillus subtilis所产酶在50℃时酶活最高。因此菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所产普鲁兰酶的最适作用温度分别为60℃、65℃和50℃。

图1 温度对普鲁兰酶活力的影响

将普鲁兰酶液分别在不同温度下保温60 min后，再按1.3.3的方法测定残余酶活，以活力最高者为100%对照，试验温度对3种菌株所产普鲁兰酶稳定性的影响，结果见图2。由图2可知，菌株Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶在低于65℃时稳定性较好，残余活力在76%以上，温度高于65℃后，酶活开始迅速下降；菌株Bacillus amyloliquefaciens所产酶热稳定性范围为低于70℃，残余活力在80%以上；而菌株Bacillus subtilis所产酶的热稳定性较前两者稍差，残余活力在80%以上的温度范围为低于55℃。

图2 温度对普鲁兰酶稳定性的影响

2.2 pH对普鲁兰酶活性及稳定性的影响

分别于不同的pH值下测定普鲁兰酶活力，以活力最高者为100%对照，试验pH对3种菌株所产普鲁兰酶活力的影响，结果见图3。由图3可知，pH对3种菌株所产酶的活性均有较大的影响。菌株Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶在pH5.0～5.4范围内对底物普鲁兰糖分解能力最强，酶活性最高；菌株Bacillus amyloliquefaciens所产酶在pH7.0～8.0范围内对底物的分解能力最强，而菌株Bacillus subtilis在pH5.4时酶活性最高。因此，菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所产普鲁兰酶的最适作用pH分别为5.0～5.4、7.0～8.0和5.4。

图3 pH对普鲁兰酶活力的影响

将普鲁兰酶液在不同pH值缓冲液中于室温保持24 h后，再按1.3.3的方法测定残余酶活，以活力最高者为100%对照，试验pH对3种菌株所产普鲁兰酶稳定性的影响，结果见图4。由图4可知，菌株Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶在pH4.0～7.5范围内表现出较高的稳定性，残余酶活力在88%以上，超出此pH范围后酶的稳定性下降；菌株Bacillus amyloliquefaciens所产酶在pH6.0～8.0范围内稳定性较高，残余活力在90%以上；而菌株Bacillus subtilis所产酶的较高稳定性表现在pH4.4～7.5范围内，残余酶活力在86%以上。

图4 pH对普鲁兰酶稳定性的影响

2.3 耐热耐酸普鲁兰酶的确定

菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所产普鲁兰酶的最适作用温度、最适作用pH及热稳定性和酸碱稳定性范围见表1。

表1 3种菌株所产普鲁兰酶的最适作用温度、pH及稳定性范围

从表1可以看出，菌株Halococcus sp.Z1和Bacillus amyloliquefaciens所产普鲁兰酶具有较高的最适作用温度和热稳定性，符合耐热的特性；菌株Halococcus sp.Z1和Bacillus subtilis所产普鲁兰酶的最适作用pH在pH5.0～5.4和pH5.4，酸碱稳定性分别在pH4.0～7.5和pH4.4～7.5范围内，具有耐酸的特性。综合考虑，菌株Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶既具有耐热又具有耐酸的特性，因此以菌株Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶作为后续试验样品。

2.4 普鲁兰酶的纯化

普鲁兰酶经盐析、透析、离子交换和凝胶过滤后，结果见表2。经纯化后，普鲁兰酶的纯化倍数为10.78倍，酶活力回收率为26.91%。DEAESephadex A25离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析的洗脱曲线分别见图5和图6。

2.5 普鲁兰酶纯度鉴定和分子量测定

将纯化后的普鲁兰酶及标准分子量蛋白进行SDS-PAGE，电泳结果见图7。纯化后的普鲁兰酶经SDS-PAGE后只有一条蛋白质谱带，说明该酶达到了均一的程度。测得该普鲁兰酶的相对分子质量约为81 700。

表2 普鲁兰酶的纯化结果

图5 普鲁兰酶的DEAE-Sephadex A25柱洗脱曲线

图6 普鲁兰酶的Sephadex G-100柱洗脱曲线

图7 普鲁兰酶的SDS-PAGE图

2.6 动力学参数

将普鲁兰酶与不同质量浓度的普鲁兰糖溶液保温反应，测定反应速度，以反应速度的倒数为纵坐标（1/V），普鲁兰糖质量浓度的倒数（1/［S］）为横坐标作Lineweaver-Burk图，结果如图8所示，从而得出普鲁兰酶米氏常数Km为0.24 mg/mL，Vm值为10.11 μmol/（min·mL）。

图8 普鲁兰酶Lineweaver-Burk图

3 结论

对实验室筛选得到的具有较高酶活的菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis的酶学性质进行了简单的初探，研究表明Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶最适反应温度为60℃，在低于65℃范围内较稳定，最适反应pH为5.0～5.4，在pH4.0～7.5范围内较稳定。相对菌株Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所产酶而言，菌株Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶具有耐热耐酸性质，较适合于工业生产应用。

对菌株Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶进行了分离纯化，测得其相对分子质量为81 700，Km值为0.24 mg/mL。

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Purification and properties ofpullulanase

ZHOUNian-bo*
（Department ofbioengineering，Wuhan bioengineeringinstitute，Hubei Wuhan430415，China）

Heat-resistance and acid-resistance of pullulanase from Halococcus sp.Z1,Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis was studied.The pullulanase from Halococcus sp.Z1 was purified by ammonium sulfate fractionation, dialysis,DEAE-SephadexA25 ion-exchange chromatographyand sephadexG-100 gel filtration,and partial enzymatic properties was examined.It is stable below65℃and within the pH range from4.0～7.5.Its optical temperature is 60℃and optical pH is 5.0～5.4.The purified pullulanase was demonstrated bySDS-PAGE tobe a homogeneous protein.The molecularweightofpullulanaseis8.17×104，andtheMichaelisconstantis0.24 mg/mL.

pullulanase；purification；property

TS201.2+5

A

1673-6044（2014）01-0037-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.01.012

*周念波，男，1979年出生，2011年毕业于湖北大学生化与分子生物学专业，硕士，工程师。

2013-12-06