改良掺食法建立苯巴比妥成瘾大鼠模型＊

韩 彬，王国俊△，傅 萍，叶 云

（1.泸州医学院附属医院药剂科，四川泸州646000；2.四川省食品药品检验所，成都611731）

药物成瘾（addiction）是滥用药物的后果，指习惯于摄入某种药物而产生的一种依赖状态，撤去药物后可引起一些特殊的症状即戒断症状，又称药物依赖性。成瘾性药物可诱发欣快感或缓解疼痛，持续使用促使中枢神经系统发生适应性改变，导致出现耐受性、依赖性、嗜欲性和复发性［1］。苯巴比妥是一种临床应用非常广泛的催眠镇静药物，随着其新的药理作用不断被发现，大量使用此类药物所带来的药物成瘾已经成为临床日益重视的问题。

既往文献中对于巴比妥类药物成瘾的研究，一般采用苯巴比妥或者巴比妥，用大鼠、小鼠、狗、猴为试验对象，一般是采用剂量递增的灌胃、腹腔注射、掺食的方式［2］。灌胃或腹腔注射造模方法报道较多：建立大鼠苯巴比妥成瘾模型多历时90 d左右，操作要求较高，对大鼠损伤较大［3］；国内掺食法造模较少报道：一般第1 周内让大鼠日摄入药量达100 mg／kg，逐渐增加剂量到600 mg／kg，历时10 周以上［2］，造模耗时较长；国外有报道掺食法历时40 d 左右建立苯巴比妥成瘾模型，但剂量递增方法不尽相同［4］。模型检验一般采用停止摄入药物方式自然戒断、中枢兴奋药催促戒断以验证造模是否成功［5］。

本实验参考国内外文献报道［3-6］，对既往造模方法加以改进，选用大鼠为实验动物，采用掺食法造模，苯巴比妥起始剂量75 mg／kg，逐日递增剂量，经45 d，模型分别采用文献报道的催促戒断法及自然戒断法加以检验，结果表明大鼠形成了稳定的苯巴比妥依赖。本法操作简单，造模时间较既往明显缩短，有效地避免了长期灌胃及注射对大鼠造成的痛苦，无大鼠死亡，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠雌雄各半，重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司提供，动物批准号SCXK（渝）2012-0008，体质量150～200 g。所有大鼠自由摄食、饮水1 周适应环境。

1.2 药品与试剂 苯巴比妥片，每片30 mg，上海信谊药厂有限公司提供，批号120401；异烟肼注射液，规格2 m L：100 mg，天津药业集团新郑股份有限公司提供，批号1112281。

1.3 实验方法

1.3.1 造模方法80 只大鼠分为对照组（催促戒断对照组、自然戒断对照组），造模组（苯巴比妥催促戒断模型组、苯巴比妥自然戒断模型组）共4 组，每组20 只，雌雄各半。苯巴比妥造模组用剂量递增的苯巴比妥片粉末掺入粉末状的大鼠食物喂养，药物剂量为结合临床，以Meeh Rubner 公式即人与大鼠间药物剂量体表面积换算关系为依据［7］，并参考相关动物试验［5-6］及前期试验［8-9］的用药剂量而定。1～10d 苯巴比妥起始浓度为75 mg ·kg-1 ·d-1，11～20d 剂量为120mg ·kg-1 ·d-1，21～30 d 剂量为165 mg ·kg-1 ·d-1，31～45d 剂量为210 mg ·kg-1 ·d-1。对照组则用普通的粉末状饲料喂养。造模第33 天苯巴比妥催促戒断模型组用催促戒断试验验证成瘾模型制造进展，自然戒断组继续喂养至第45 天后停药。

1.3.2 模型检验 大鼠催促戒断试验模型检验：造模第33天，催促戒断试验验证成瘾模型制造进展，苯巴比妥催促戒断模型组大鼠，用普通的不含苯巴比妥的食物代替含苯巴比妥的混合食物喂养大鼠并称取重量，戒断16 h 后用诱导惊厥阈下剂量150 mg／kg 的异烟肼对大鼠给予腹腔注射［10-11］，观察半小时内的大鼠反应并统计惊厥率；直至第72 小时，每日称取重量［12］。与对 照组相 比较，χ2检验惊厥率差异的显著性，t检 验重量减轻程度差异的显著性。大鼠自然戒断试验模型检验：造模第46 天，苯巴比妥自然戒断模型组大鼠停药，称取重量，每隔8 h 进行戒断症状观察并评分直至72 h［12］，统计戒断症状评分，每日称取重量，与对照组相比较，t检验差异的显著性。

1.3.3 对照组及造模组脑切片情况（光镜下情况）上述各组大鼠处死，脑组织切片，HE 染色，光镜下观察对比切片情况。

1.4 统计学处理 数据采用SPSS18.0 软件进行统计分析，计算各组戒断后的体质量变化百分率、催促戒断各组惊厥百分率、自然戒断各组戒断症状评分，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

采用上述掺食法建立大鼠苯巴比妥成瘾模型，分别采用催促戒断、自然戒断两种方法进行模型检验，表明该方法能成功用于建立大鼠苯巴比妥成瘾模型，方法简便可行，造模过程中未发生大鼠死亡。

2.1 大鼠苯巴比妥成瘾模型催促戒断法模型检验结果 催促戒断组的惊厥发生率为60%，明显高于对照组（P＜0.05），见表1。催促戒断组的体质量明显下降，至72 h 仍没恢复，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 大鼠注射INH后惊厥情况

表2 大鼠催促戒断后体质量变化情况（±s，%）

表2 大鼠催促戒断后体质量变化情况（±s，%）

＊：P＜0.05，与对照组比较。

戒断后 对照组 催促戒断组24 h 0.58±1.48 -2.06±1.85＊48 h -0.71±1.29 -5.11±2.44＊72 h 0.16±1.94 -4.32±2.69＊

2.2 掺食法大鼠苯巴比妥成瘾模型自然戒断法进行模型检验结果 戒断后第16 小时开始模型组有大鼠出现戒断症状，如兴奋不安、嘶叫、流涎、稀便、竖毛、颤抖、四肢乱抓。24～48 h症状出现到达顶峰，开始出现阵发性惊厥，呼吸急促，四肢痉挛，全身皮肤发白，牙关打颤，个别大鼠出现强直性阵挛甚至死亡（图1～3）。48～72 h 症状稍有减轻，体质量下降尤为明显，至72 h 仍未恢复。自然戒断组24～72h 的戒断症状评分（标准见表3）与对照组差异有统计学意义（P＜0.05），见表4，体质量减轻与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

图1 大鼠兴奋、挣扎

图2 大鼠阵发惊厥、跌倒

图3 大鼠强直惊厥

表3 大鼠戒断症状评分标准＊

2.3 成瘾大鼠脑切片情况 大鼠苯巴比妥成瘾，与脑细胞的凋亡相关联［6］，一般认为大鼠对苯巴比妥的依赖性越强，其额叶脑细胞凋亡数目占额叶脑细胞总数比例越高，将上述大鼠进行断头取脑额叶部位，切片HE染色，可观察到对照组与模型组对比脑细胞形态的变化［9，13］。对照组：脑细胞形态完好，细胞核清晰可见，胞质颜色正常（图4）造模组：细胞体积小，胞质浓缩，核染色质以不同形式凝聚：有的凝聚于核膜之下；有的呈典型的新月形；有的凝聚成一大块或几小块占据整个核区（图5、6）。

表4 大鼠自然戒断评分（±s，n＝20）

表4 大鼠自然戒断评分（±s，n＝20）

＊：P＜0.05，与对照组比较。

时间 对照组 自然戒断组8 h 0.05±0.220.15±0.3716 h 0.10±0.310.35±0.4824 h 0.05±0.221.15±0.67＊32 h 0.10±0.311.80±0.69＊40 h 0.05±0.222.89±0.69＊48 h 0.00±0.003.31±0.66＊56 h 0.15±0.363.03±0.84＊64 h 0.10±0.311.94±0.87＊72 h 0.05±0.221.72±0.75＊

表5 大鼠自然戒断后体质量变化情况（±s，%）

表5 大鼠自然戒断后体质量变化情况（±s，%）

＊：P＜0.05，与对照组比较。

戒断后 对照组 自然戒断组24 h 0.08±1.41 -4.59±1.07＊48 h 0.71±1.62 -9.16±2.98＊72 h 0.33±1.97 -7.99±3.06＊

图4 对照组脑细胞HE 染色切片（×200）

图5 催促模型组脑细胞HE 染色切片（×200）

图6 自然戒断组脑细胞HE 染色切片（×200）

3 讨 论

戒断反应是药物成瘾的明显特征之一，指停止使用药物或减少使用剂量或使用拮抗剂占据受体后所出现的特殊的心理症候群，其机制是由于长期用药后，突然停药引起的适应性反跳，症状是出现反跳性的兴奋性升高。苯巴比妥是一种在临床使用广泛，成瘾性较大的催眠镇静抗癫痫药，本身有中枢神经系统抑制作用，能够提高惊厥的发作阈值［12］。然而长期使用该药后忽然停药，却会导致包括自发性的惊厥在类的戒断症状出现。在苯巴比妥模型建立过程中，停药戒断后的亢奋、厌食、多汗、体质量减轻、自发性惊厥等症状可以作为动物身体依赖的观察指标，也可以根据程度的不同用来划分戒断症状的严重等级。

本试验动物用药起始剂量（75 mg／kg）为结合临床，以Meeh Rubner 公式即人与大鼠间药物剂量体表面积换算关系为依据［7］，并参考相关动物试验［4-6］及前期试验［8-9］的用药剂量而定，此剂量会在一定程度上对大鼠造成轻微的中枢抑制，但一般不会造成严重的中枢而抑制影响活动进食。每日早上用少量食物粉末混合药物粉末，密切观察大鼠，保证全部食物及药物均完全摄入大鼠体内，从而有效避免大鼠因为进食饮水习惯导致的药物未完全摄入体内。待大鼠吃光后再给予剩余的正常粉末食物。在掺食法造模过程中需注意的是：初期给药期间如果出现大鼠中枢抑制极其严重已经不能正常进食可以略微减少给药的剂量再逐渐递增，在计算催促戒断的惊厥率的时候，只奔跑未倒地和奔跑倒地的动物，均应一并计算惊厥发生率。

与现有的灌胃法和腹腔注射法相比，掺食法建立苯巴比妥依赖模型的优势在于可以让大鼠以最自然的方式摄入药物，灌胃法导致的食道损伤和腹腔注射法导致的局部感染溃疡等问题都可以避免，可以更好地模拟患者平时长期服用药物形成的药物依赖，大大减少实验动物在实验过程中的死亡数量（采用文献报道方法灌胃法造苯巴比妥成瘾大鼠模型时发现该方法操作要求较高，动物死亡数较多，且造模历时较长，由于病死率高的原因模型成型率较低）；而与现有文献的掺食法需要造模时间10～12 周相比，本法将大鼠的初始摄药剂量略微增加，加大了药物的递增梯度剂量，以起始剂量75 mg ·kg-1 ·d-1 开始用药（以出现中枢抑制状态为标志［5］）直至剂量高达210 mg ·kg-1 ·d-1，造模时间仅仅为45 d，除戒断检验模型时有大鼠出现惊厥死亡外，造模过程中无大鼠死亡，在第33 天用催促戒断的方式验证成瘾模型制造进展，45 d 就可以观察到自然戒断症状，与以往文献相比较，最终成型的模型在相同的时间段均能观察到相似的戒断症状和体质量减轻情况。多年的研究表明药物滥用对大脑有损伤，药物滥用导致的成瘾是一种脑疾病，Cadet 等［14］将药物成瘾造成的脑细胞丧失与细胞凋亡机制联系在一起，认为药物成瘾的神经损伤是由激活调控细胞凋亡的分子机制引起的。本实验中造模组大鼠脑切片图显示：造模组大鼠脑细胞呈现明显的凋亡改变，符合成瘾大鼠脑细胞改变情况，进一步表明造模成功。

近期研究发现，成瘾不仅有关于脑细胞的凋亡调控［15］，而且与学习和记忆也密切相关［16］，本造模法建立的苯巴比妥成瘾模型所造成的身体依赖结果可靠，重复性好，可以成为成瘾脑细胞凋亡调控与成瘾学习记忆能力研究的基础。

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