法舒地尔提高猪缺血诱导心脏死亡供者心保存效果的实验研究

陈伟民，李 峰，黄达德，陈文广

（广东省广州市第一人民医院心胸外科510180）

心脏移植已成为治疗终末期心脏病的惟一有效手段。但是供心短缺严重制约了心脏移植的进一步发展。由于脑死亡供者（DBD）日趋匮乏，人们开始寻找DBD以外的供体。更广意义上的心脏死亡供者（DCD）器官重新得到重视，包括开展DCD心移植的探索［1-5］。近年一种新的药物Rho-激酶（ROCK）的抑制剂“法舒地尔”在保护器官抗缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I-R）损伤方面，效果显著［6-7］。本课题旨在探讨法舒地尔对猪缺血诱导的DCD心的保护机制及保存效果，为今后人类缺血诱导的DCD供心保护、开发和利用，提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康杂种家猪16只，雄性，体质量（28±3）kg，由广州医学院实验动物中心提供，分为实验组和对照组各8 只。

1.2 试剂 盐酸法舒地尔注射液，规格为30 mg／2 m L，购自天津红日药业股份有限公司。其他化学试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。

1.3 实验方法 参照本研究组既往的方法［8-9］进行。

1.3.1 实验组 （1）动物氯氨酮15～20 mg／kg肌肉注射诱导麻醉；氯氨酮2 mg／kg 间断静脉注射、持续异丙酚4～6 mg·kg-1·h-1 静脉泵入维持麻醉；维库溴铵2 mg／kg静脉注射诱导肌松和0.1 mg ·kg-1 ·h-1 静脉泵入维持肌松。麻醉成功后气管切开并插管、固定，呼吸机辅助呼吸，采用容量控制型通气模式，吸入氧浓度（FiO2）40%～50%，潮气量（VT）8～10 mL／kg（开胸后12 m L／kg），通气频率（F）20～25次／min。进行心电监测、鼻咽温度监测。解剖显露颈静脉，穿刺置管建立静脉通道，测定中心静脉压；解剖显露股动脉，穿刺置管，接压力换能器和心电监测仪，监测动脉血压；抽血监测动脉血气（p H 、PO2、PCO2、SO2%、HCT）。正中切口开胸，撑开胸骨，剪开心包，显露心脏。游离升主动脉、主肺动脉、上腔静脉、下腔静脉，稍抬起心尖，显露冠状静脉窦，细针穿刺采血，测定基础心肌酶；颈静脉注射肝素（3 mg／kg，要求ACT＞480 s），经右心房荷包缝合，盲性插入冠状静脉窦逆行插管，引出冠状动脉血液，量筒测定半分钟冠状动脉血流量（×2 为冠状动脉流量），冠状动脉血液立即回注入动物血管内。经左心室心尖部荷包缝合处尖刀戳孔，插入测压管，接换能器、BIOPAC MP150数据放大器及PO-NE-MAH数字化数据采集／左心压力分析系统，测定左心室各项基础血流动力学数据。

1.3.2 动物放血、建立缺血诱导DCD心模型 经主动脉根部插入“Y”灌注针，固定。经“Y”灌注针一侧接头连接右心吸引，开始快速放血，诱导心脏停跳［心脏缺血至完全停跳，历时（14±4）min］。血液引入人工心肺机储血器中，加入其他成分（1000 mL 血加入肝素20000 IU、甲泼尼龙琥酸钠500 mg、青霉素40 万IU、庆大霉素12 IU、葡萄糖1.1 g、普通胰岛素10 IU）进行预充。心脏缺血停跳后（血压为零，心脏停止跳动或室颤）继续室温下静置，观察25 min，完成DCD模型建立。

1.3.3 切心 心脏室温下静置25 min 后，迅速将上腔静脉用丝线两道高位结扎，于结扎线之间切断上腔静脉，下腔静脉上钳阻断，高位主动脉阻断，于主动脉根部灌注含法舒地尔的冷stanford 液（4 ℃，20mL／kg，60mm Hg 灌注），迅速剪断下腔静脉作右心减压；迅速剪开左心耳，行左心减压。靠近心包返折处切断所有右侧肺静脉、左侧肺静脉；心包腔放置冰泥（保持心脏局部深低温）。灌注完毕后，在弓部主动脉（左颈总动脉和左锁骨下动脉之间）处切断主动脉，在肺动脉分叉处切断主肺动脉，切断心脏后面附着的心包组织，取出心脏，立即置于冷stanford 液（4 ℃）中，心脏灌注插头插入主动脉，固定，迅速悬挂在langendorff 装置上（图1）。该装置基于心脏langendorff灌注原理，并整合人工心肺机，自行构建。人工心肺机储血器中血，经鼓泡肺充分氧合、加温，主泵将氧合温血泵至langendorff 灌注装置储血瓶中。通过调整储血瓶液面高度，达到不同离体心脏灌注压。由恒温水浴加温后，使灌注系统保持恒温。心脏灌注过程中，冠状静脉窦回流血，以右心吸引回收至储血器中，再次循环。

1.3.4 供心离体灌注 （1）平衡：供心悬挂在离体灌注装置上后，开启离体心脏灌注系统，充分排气后开放供心灌注通路，开始氧合温血灌注，心脏复跳（自动复跳，或必要时除颤）。平衡初始，以40 mm Hg 汞柱低压灌注；复跳成功后，改为常规60 mm Hg 汞柱压力灌注。右心室前壁放置一对起搏电极，予150 次／min 起搏；整个灌注实验过程中，灌注系统恒温在38.0℃，间断监测血气（p H、PO2、PCO2、SO2%、HCT）。经左心耳置入左心室测压水囊，接换能器、BIOPAC MP150数据放大器及PO-NE-MAH数字化数据采集／左心压力分析系统，监测各项心脏血流动力学指标；量筒收集1 min 冠状动脉回流血，为冠状动脉流量（coronary blood flow，CBF）；取冠状动脉回流血，测定心肌酶；平衡20 min。平衡结束后，要求HR维持在每分钟（150±3）次左右、LVEDP 15～25 mm Hg、LVPDP≥90 mm Hg 及CBF保持稳定，未达到要求的猪心剔出实验。（2）冷浸浴原位保存：平衡结束后，钳闭主动脉灌注通路，停止心脏氧合血灌注；关闭心脏起搏器；经供心灌注管的侧孔，予单纯冷stanford 液再次灌注（4 ℃，10mL／kg，60mm Hg 重力），心脏停跳。同时，将含法舒地尔的冷stanford 液（1 L，4 ℃）加入储心瓶，供心保留在原位不动（储心瓶外壁用足量冰屑包埋），作供心原位冷浸浴保存2 h。在此期间，停止恒温水浴、体外循环机，氧合器血保持旁路循环。（3）供心复跳：供心保存结束后，立即摒弃储心瓶中的stanford 液，生理盐水灌洗储心瓶及下游管道1 次。重新开启离体心脏灌注系统，开放供心灌注通路，氧合温血恢复灌注，心脏渐复跳（自动复跳或必要时除颤），模拟临床上心脏植入吻合成功后，主动脉开放心脏复跳过程。主动脉开放后复灌1 h，停止心脏灌注，取下供心，结束实验。

图1 猪心脏langendorff 灌注装置

1.3.5 对照组 对照组整个实验过程中不使用“法舒地尔”（用等量生理盐水代替），其余同实验组。

1.4 监测指标

1.4.1 心脏血流动力学 缺血前、平衡结束后、供心保存后的复灌期，持续监测LVEDP、LVPDP、＋dp／dt、-dp／dt、HR。

1.4.2 CBF缺血前、平衡结束后、供心保存复灌后30 min、复灌后60 min 时点，用量筒测定1 min冠状动脉血流量，为CBF。

1.4.3 心肌酶测定 缺血前、平衡结束后、供心保存后的复灌后30 min、复灌后60 min 时点采冠状静脉回流血，测定肌酸激酶（creatine，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CKMB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）。使用本院生化室全自动血液生化仪及Beckman Coulter 公司试剂完成测定。

1.4.4 心肌组织含水量 灌注实验结束后，取下心脏，取右心室心肌组织约2 g，试纸拭干水分，称湿质量，80℃恒温干燥24 h，称干质量，按公式计算：心肌组织含水量（%）＝（心肌组织湿质量-干质量）÷心肌组织湿质量×100%。

1.4.5 心肌梗死量（IV）上述心脏切除右心室，保留左心室，垂直左心室纵轴方向切成6 块切片，标本以1% 氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazoliumchloride，TTC）磷酸缓冲液染色20 min，10% 甲醛固定24 h，参照美国哈佛大学医学院BID医学中心方法［10］，观察并测定心肌IV：即将梗死面积描记于专用薄膜上，在PC机上采用图像处理软件测量每张切片断面总面积（total area，TA）及断面中各小梗死灶面积，计算累积梗死灶面积（infarction area，IA），切片称质量。按下列公式计算出IV：每一切片梗死质量（mg）＝｛［上断面（IA÷TA）］＋［下断面（IA ÷TA）］×切片质量（mg）｝／2；IV＝∑各切片梗死质量（mg）／∑各切片质量（mg）。

1.4.6 心肌电镜观察 取左心室心尖部心肌组织标本（1 mm3大小），立即置于4 ℃2.5%戊二醛固定，50%～100%乙醇多级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀染色，透射电镜观察。

1.5 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，计量资料以±s表示，两样本t 检验（两样本方差有显著差别，采用t′检验），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血流动力学指标变化 所有动物均完成实验，包括达到平衡、保存结束后成功复苏。缺血前、平衡后两组比较，各项心脏血流动力学指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、2。

表1 缺血前心脏血流动力学（±s）

表1 缺血前心脏血流动力学（±s）

★：P＞0.05，与对照组比较。

组别 LVEDP（mm Hg）LVPDP（mm Hg）HR（次／min） ＋dp／dt -dp／dt 15±0.5124.7±4.7120±41949±38.61428±48.9实验组 16±0.3★ 123.9±5.2★ 121±5★ 1972±43.2★1403±44.7对照组★

表2 平衡后心脏血流动力学（±s）

表2 平衡后心脏血流动力学（±s）

★：P＞0.05，与对照组比较。

组别 LVEDP（mm Hg）LVPDP（mm Hg）HR（次／min） ＋dp／dt -dp／dt 22±2.1109±1.5150±31790±47.31358±40.4实验组 21±0.2★ 118±0.2★ 150±31803±45.7★1362±36.0对照组★

平衡开始时（实验组及对照组各1例）以及心脏保存结束复灌开始时（实验组2例、对照组3例）供心需除颤复跳。复跳后心肌红润，为窦性心律，自主HR为每分钟128～142 次；所有心脏均给予起搏，每分钟150 次起搏，转为起搏心律，心脏收缩有力。两组在复灌后30 min，实验组心功能优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表3；在实验结束时（复灌后60 min），两组心功能有下降趋势，但实验组仍优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表4。

2.2 CBF变化 缺血前、平衡后，两组差异无统计学意义（P＞0.05）；复灌后30 min、复灌后60 min，实验组均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表5。

表3 复灌后30 min 心脏血流动力学（±s）

表3 复灌后30 min 心脏血流动力学（±s）

★：P＜0.01，与对照组比较。

组别 LVEDP（mm Hg）LVPDP（mm Hg）HR（次／min） ＋dp／dt -dp／dt 21±3.9128±3.0150±31780±60.41349±45.0实验组 17±0.2★ 142±3.6★ 150±32228±48.9★1870±48.5对照组★

表4 复灌后60 min 心脏血流动力学（±s）

表4 复灌后60 min 心脏血流动力学（±s）

★：P＜0.01，与对照组比较。

组别 LVEDP（mm Hg）LVPDP（mm Hg）HR（次／min） ＋dp／dt -dp／dt 35±3.9112±3.1150±31572±56.21144±41.2实验组 23±0.2★ 138±3.4★ 150±32043±42.5★1782±44.6对照组★

表5 不同时点CBF 测定（±s，m L／min）

表5 不同时点CBF 测定（±s，m L／min）

★：P＜0.01，与对照组比较。

组别 缺血前 平衡后 复灌后30 min复灌后60 min对照组212±21.6204±20.3170±18.6146±16.4实验组 214±22.7206±21.3198±12.4★ 176±15.4★

2.3 心肌酶 两组缺血前、平衡后，各项心肌酶指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。复灌后30 min、复灌后60 min，两组均显著升高，实验组升高幅度明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2 冠状动脉回流血心肌酶测定

2.4 心肌含水量 对照组（80.3%±1.2%）明显高于实验组（77.9%±0.8%），差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.5 心肌梗死量 两组心肌各切片标本，肉眼可见散在、局灶性分布的梗死病灶。对照组（25.0%±0.4%）心肌梗死量明显高于实验组（16.0%±0.2%），差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.6 心肌电镜观察 （1）对照组：细胞核椭圆形、不规则形，核膜清晰，肌纤维排列正常，闰盘、Z 带欠清晰，线粒体轻度肿胀，部分嵴溶解，糖原颗粒减少（图3）；（2）实验组：心肌细胞核呈梭形、长杆状、椭圆形，核膜清晰，常染色体呈细颗粒状，异染色体分布在核膜内侧，心肌纤维排列有序，闰盘、Z带清晰可见，肌原纤维间有杆状线粒体，有丰富糖原颗粒。线粒体均匀排列，可见清晰的线粒体嵴和膜（图4）。

图3 对照组电镜图像（×10000）

图4 实验组电镜图像（×10000）

3 讨 论

3.1 猪DCD心动物模型的探讨（1）猪DCD心离体心脏灌注模型选择：哺乳动物离体心脏灌注系统的概念，是由Oscar Langendorff［11］在一个多世纪前提出的，在生理学和药理学的研究中得到广泛应用。该技术使研究者在心脏无神经、体液调节等影响因素的条件下，可以研究其心功能、HR以及冠状动脉的特性等。通过升主动脉向冠状动脉灌注，由于灌流液压的作用，动脉瓣关闭，灌流液顺势流入冠状动脉，从而使心脏维持跳动数小时。其缺点为“非工作心”，不能改变心脏的前／后负荷做功。心脏只对开放的循环回路系统泵血。为此，Neely及Morgan［12］在20 世纪60年代提出“工作心”模型，并用于研究氧耗和心肌负荷关系。本研究重点观察心肌缺血-再灌注损伤，故仍采用Langendorff“非工作心”模型，其符合本实验的要求。（2）取心及主动脉插管技巧：尽量留有足够的主动脉长度，为此，需高位切断主动脉，以免插灌注管时，插管末端有堵塞冠状动脉开口可能。因此，本研究均选择在主动脉弓部（左颈总动脉和左锁骨下动脉之间）横断主动脉，取出供心，置于stanford 液（4 ℃）后，快速结扎弓部的头臂分支血管，主动脉断端插入主动脉灌注管，结扎固定，衔接至离体灌注装置上。（3）判断供心死亡的标准：以肉眼观察心脏完全停止跳动（或室颤）为心脏死亡标准，而非心电图的改变。因心脏停跳早期，心电图仍可有心电活动，即“电-机械”分离现象。（4）灌注压力选择及心麻液使用：本研究体外灌注时，供心在切心前及平衡后需再次停跳时，均采用冷stanford 液（4 ℃）灌注。有实验表明，切心时不用冷心麻液，结合在Langendorff 模型上全程采用低压（40 mm Hg）灌注，反而可提高供心保存质量［13］。作者仍认为，切心前使用stanford 液灌注；平衡结束后需再次停跳时，使用冷stanford 液灌注可使心脏迅速停跳。结合复跳前短暂控制性低压（40 mm Hg）灌注，一旦心脏复跳后恢复常规压力（60 mm Hg）灌注，在减轻心肌损伤方面应更有效。

3.2 盐酸法舒地尔对DCD供心的保护效果 （1）法舒地尔是一种蛋白激酶抑制剂，为细胞内钙离子拮抗剂。其抑制的对象ROCK，是一类相对分子质量为160 ×103的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可以介导下游一系列蛋白［如：肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）、肌球蛋白磷酸酶（MYPT-1）等］磷酸化／脱磷酸化反应［14］。法舒地尔通过肌球蛋白轻链磷酸化，阻断血管收缩过程的最终阶段，扩张血管及抑制血管痉挛；抑制其他缩血管物质，阻止Ca2＋内流，抑制无Ca2＋存在的条件下肾上腺素或前列腺素所引起的血管收缩反应；增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的形成，抵抗氧自由基，抑制细胞骨架蛋白的降解，具有抗细胞凋亡作用；对中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞的聚集、变形、移动、浸润和吞噬具有直接的抑制作用，拮抗炎症因子分泌，发挥抗炎作用；增加内源性NO合成酶（e NOS）的表达，促进NO生成［15］，产生直接扩血管作用。Shibata 等［6］证实，在缺血前及再灌注早期应用法舒地尔，可减轻局限性心肌顿抑模型冠状动脉阻断复制中的心肌顿抑损伤；Kobayashi等［7］也证实，使用法舒地尔，可改善UW液冷浸浴保存24 h 后的兔心心功能。再灌注前应用法舒地尔，能够有效预防内皮细胞功能障碍及减轻心肌梗死的发展。尤其在再灌注早期，缺血的心肌中Rho 的表达明显上调和ROCK激酶被激活［16］。本研究中，在stanford 灌注液中添加法舒地尔干预，观察到两组在实验结束后切取的心肌标本，存在梗死病灶，都为少量、散在的梗死灶改变，但实验组的梗死量明显小于对照组。因此，推测在切心前及供心冷保存期间应用法舒地尔具有减轻I-R损伤的作用。（2）心肌酶：复灌后30 min、复灌后60 min 检测各项心肌酶指标，发现均明显升高，实验组升高幅度显著小于对照组。由此，推测盐酸法舒地尔可以减少心肌酶的漏出。（3）CBF：法舒地尔具有强大的血管舒张作用。Yada 等［17］在狗的实验模型上也观察到，ROCK抑制剂能扩张血管及增加CBF，且呈剂量依赖性，最大效应剂量为0.1 mg／kg。法舒地尔增加冠状动脉流量的作用，推测与冠状动脉血管内皮功能得到保存及直接扩血管作用有关。血管内皮功能改善，有助于心肌灌注的改善，以及冷保存期后心肌蓄积的毒性代谢废物的排出。内皮细胞功能受损，表现为内皮细胞释放的NO下降。NO是由eNOS，以L-精氨酸为底物所合成，其可调节血管张力。（4）心功能变化：两组在失血前各项血流动力学指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。实验组取心时，已用了法舒地尔，平衡结束后，与对照组比较，仍未见到血流动力学变化的差异，可能与法舒地尔作用时效性有关，即此时法舒地尔尚未起效。冷浸浴保存结束后复灌30、60 min，实验组各项血流动力学指标明显优于对照组，包括反映心脏舒张功能的指标（LVEDP、-dp／dt）和收缩功能的指标（LVPDP、＋dp／dt）。推测在这些时间点，取心时使用的法舒地尔开始起效，并与冷浸浴保存时使用的法舒地尔产生了叠加效应。（5）法舒地尔介入的“时间窗”：本研究在缺血前不使用法舒地尔，是基于DCD器官获取的原则，即在这个时段，不应使用任何与获取器官有关的，可能加速或导致死亡的任何药物（除了吗啡、异丙酚等可降低供者脱离呼吸机时痛苦的药物，尽管其可能在减轻痛苦同时，也可能存在加速死亡的重叠效应）。尽管有人作鼠无心跳供体心的研究表明，供心缺血开始后，降温到32 ℃中度低温，有助于复灌期心功能的恢复［18］，本研究仍采用室温下放置的方法，不作任何取心前的提前干预措施。且本实验在供心保存结束后的复灌期也未使用法舒地尔。因已有资料表明，法舒地尔有较强的扩血管作用，临床上，主动脉开放后复灌早期使用，有可能导致机体血流动力学不稳定，血压降低，并不推荐使用。综上所述，本研究只限于在stanford 液切心前心脏灌注，以及stanford液供心保存中使用。

本实验证明，对stanford 液心脏切心前灌注、stanford 液（4 ℃）供心浸浴保存两个时段，应用Rho 激酶抑制剂“法舒地尔”进行干预，可控制心肌梗死量，降心肌细胞酶，抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌水肿，改善供心冠状动脉灌注，改善心功能，保存心肌超微结构完整性。提示法舒地尔能够减轻心肌I-R损伤，提高猪缺血诱导心脏死亡供者心保存效果。

（志谢：感谢本院麻醉科和体外循环组的大力协助和支持！）

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