自噬与紫杉醇敏感性

刘穗玲 李小毛

自噬是指胞浆内大分子物质和细胞器在膜包囊泡中大量降解的生物学过程。细胞通过自噬作用降解多余的或受损的大分子物质及细胞器，重新利用降解产物，维持细胞内合成和分解代谢的平衡，保持内环境稳定。自噬广泛存在于真核生物的病理生理过程中。研究发现，许多抗肿瘤药物可诱导肿瘤细胞发生自噬，且自噬可影响肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。紫杉醇是目前广泛应用的广谱抗肿瘤药物，主要通过诱导肿瘤细胞凋亡发生作用，近年研究发现，紫杉醇可诱导自噬，现对自噬与紫杉醇敏感性的相关研究综述如下。

一、自噬与抗肿瘤药物

1.自噬概述

根据物质到达溶酶体腔的方式不同，自噬可分为巨自噬、微自噬及分子伴侣介导的自噬。通常所指的自噬主要是指巨自噬。自噬过程主要包括自噬的诱导、前自噬结构(PAS)的形成、自噬体的延长及自噬溶酶体形成和降解等过程。电子显微镜可观察到自噬体位于细胞质中，呈双层膜结构，其中包裹着尚未消化的线粒体等胞内细胞器。吖啶橙(AO)染色、丹酰戊二胺(MDC)染色可标记自噬体，有助于自噬体的识别。

自噬过程涉及多种自噬相关基因(Atg)，Atg基因编码相应的自噬相关蛋白。众多自噬相关蛋白中，微管相关蛋白1轻链3(LC3)和Beclin1蛋白尤其引人注目。 LC3是酵母Atg8在哺乳动物的同源物编码的蛋白，附着在自噬体膜的内侧及外侧。在自噬体与溶酶体膜融合形成自噬溶酶体后，膜表面的LC3脱落，膜内面的LC3被水解，由于LC3出现在自噬体形成的全过程，LC3被认为是自噬的有效和特殊的分子标记物[1]。Beclin1是酵母Atg6的同源基因，定位于染色体17q21上。Beclin1蛋白是第一个确定的、诱导哺乳动物自噬的自噬相关蛋白，在自噬的调节过程中发挥着重要的作用[2-3]。

自噬主要受两个复合体的调节，即哺乳动物雷帕霉素靶向蛋白(mTOR)复合体和Beclin1复合体，而这两个复合体又接受多个调节肿瘤生长的信号通路的调节。mTOR有两种复合体，包括mTORC1和mTORC2。mTOR受调节细胞生长增殖的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-AKT)信号转导通路和能量感受器AMPK通路的调节，PI3K-AKT的激活导致mTORC1激活，抑制自噬。AMPK通路的激活抑制mTORC1，激活自噬。10号染色体同源丢失性磷酸酶与张力蛋白(PTEN)在PI3K-AKT通路的上游对其产生抑制作用，因而对自噬起正向调节作用。抑癌基因P53基因，可通过激活AMPK通路或上调溶酶体蛋白DRAM对自噬进行正向调节。Beclin1则提供平台作用，使Bcl-2、死亡相关蛋白激酶(DAPK)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、UVRAG相关产物和Vps34等多个蛋白结合与其结合形成复合体并整合信息，对自噬进行抑制或活化调控。其中，Vps34是Ⅲ型PI3K 的一种，与Beclin1结合而发挥促进自噬作用，Vps34催化磷脂酰肌醇(PI)生成 PI3P，产生的 PI3P可促进自噬相关蛋白 Atg 结合到膜上，形成前自噬结构。Bcl-2是凋亡抑制蛋白，与Beclin1结合抑制自噬发生。DAPK与Beclin1结合正向调节自噬。

自噬的调控信号途径和凋亡通路相互交错影响，自噬与凋亡之间的关系大致有3种：①自噬抑制凋亡，保护细胞；②自噬为凋亡所需，自噬抑制剂可抑制细胞死亡，但凋亡抑制剂不能抑制细胞死亡；③自噬与凋亡共同促进细胞死亡，此时无论抑制自噬或凋亡细胞均转为另一条细胞死亡途径。凋亡称为Ⅰ型程序性死亡；过度自噬亦可导致细胞死亡，即自噬性死亡，也称为Ⅱ型程序性死亡。

2.抗肿瘤药物诱导自噬

目前，大多数的抗肿瘤药物是主要通过诱导凋亡杀死肿瘤细胞。文献报道，许多抗肿瘤药物在作用于肿瘤细胞的过程中可诱导自噬发生[4-7]。抗肿瘤药物诱导的自噬影响细胞的存活。有些抗肿瘤药物诱发的自噬对肿瘤细胞起保护作用，例如， 氟尿嘧啶作用于人结肠癌细胞、莱菔硫烷(sulforaphane)作用于前列腺癌细胞、伊马替尼(imatinib)作用于人恶性胶质瘤细胞均可诱导肿瘤细胞发生保护性自噬，降低肿瘤细胞对药物的敏感性，甚至耐药[7-9]。部分抗肿瘤药物则可直接或间接启动自噬引起细胞死亡，如三氧化二砷作用于T细胞白血病和骨髓增生异常综合征细胞株、苯乙基异硫氰酸酯作用于前列腺癌细胞、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)作用于软骨肉瘤细胞株均可诱导自噬性死亡[10-12]。

抗肿瘤药物诱导自噬的机制不尽相同，可分别通过抑制mTOR、上调Beclin1或同时抑制mTOR和上调Beclin1诱导自噬，诱导过程可涉及不同信号通路[13-17]。

二、紫杉醇诱导肿瘤细胞自噬及发生机制

紫杉醇于1967年首次从太平洋红豆杉树皮中被分离提取，1992年紫杉醇针剂被FDA批准上市后，现已成为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌的一线化学治疗药物，并且逐渐应用于各种恶性肿瘤的治疗。

紫杉醇作用机制至今仍未完全清楚。多数研究认为，紫杉醇是通过与微管蛋白上三磷酸鸟苷(GTP) 水解位点附近的特异性结合口袋相结合，模拟或增强GTP 的作用，促进并稳定微管蛋白的聚合, 稳定微管，防止其解离，从而导致肿瘤细胞不能形成纺锤体和纺锤丝，染色体断裂，细胞复制和移行受抑制, 肿瘤细胞阻滞在G2期和M期，分裂和增殖受抑制；紫杉醇可通过多条途径诱导肿瘤细胞凋亡，包括影响微管稳定性而诱发细胞凋亡、影响信号转导通路直接诱发细胞凋亡[18]。

近来研究发现，紫杉醇在诱导凋亡的同时，也可诱导自噬发生。Xi等[19]报道，紫杉醇在诱导人肺癌A549细胞凋亡时，AO染色的酸性小体增多，LC3、Beclin1、Atg5水平上调，提示自噬发生，研究还发现，紫杉醇可诱导人胶质U87瘤细胞、人前列腺癌PC-3细胞以及人结肠癌细胞HT-29等多个细胞株发生自噬。此外，紫杉醇在诱导宫颈癌Hela细胞、CaSki细胞、卵巢癌顺铂耐药细胞SK-OV/DDP、胃癌BGC-823细胞和SGC-7901细胞、人急性T细胞白血病Jurkat细胞、FLCN缺失的肾癌细胞等细胞株死亡过程中，均上调自噬水平[20-25]。

紫杉醇诱导的自噬可对其诱导细胞死亡产生影响。部分研究发现，自噬抵抗凋亡，减弱紫杉醇的毒性，对肿瘤细胞起保护作用。Xi等[19]在紫杉醇诱导自噬后，用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)及Beclin1小分子干扰RNA(siRNA)转染A549细胞抑制自噬，均使紫杉醇对细胞的毒性增加，说明紫杉醇诱导了保护性自噬。紫杉醇在人骨肉瘤细胞株Saos-2细胞、FLCN缺失的肾癌细胞均诱导保护性自噬[13,25]。另有研究报道，紫杉醇诱导的自噬可与凋亡共同促进细胞死亡。Sun等[21]用pc DNA 3.1-Beclin1转染宫颈癌CaSki细胞，上调Beclin1的表达，结果自噬率和凋亡率均增加，认为自噬和凋亡起协同作用。Veldhoen等[26]研究发现，紫杉醇可诱导处于非有丝分裂期的MCF-7细胞生成自噬体，分别用3-MA和ATG7siRNA、VPS34 siRNA抑制自噬，结果凋亡也同时减少，认为紫杉醇抑制自噬体的运动和成熟，使非有丝分裂期细胞自噬体生成后成熟障碍引发凋亡。

紫杉醇诱导自噬的机制尚在探索之中。研究认为，微管促使LC3整合到自噬体膜上、促进成熟自噬体从细胞内生成部位转移，参与了自噬体的形成、运动以及与溶酶体的融合过程[27-28]。紫杉醇作用于微管，其诱导的自噬是否与微管有关尚不清楚。Nottle等[29]报道，紫杉醇作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞可诱导mTOR及其下游底物p70s6k的磷酸化减弱，从而诱导自噬。Ajabnoor等[14]用紫杉醇作用于乳腺癌MCF-7细胞诱导产生紫杉醇耐药株后，发现耐药株mTOR及p70s6k的磷酸化减弱。Xi等[19]报道，紫杉醇诱导肺癌A549细胞自噬过程中，Beclin1和Atg5均上调，以Beclin1 siRNA转染细胞后，自噬受抑制，此外，紫杉醇诱导人胶质U87瘤细胞、人前列腺癌PC-3细胞以及人结肠癌细胞HT-29等细胞株发生自噬时，均发现Beclin1和Atg5上调，提示紫杉醇通过Beclin1启动自噬。Tang等[30]报道，紫杉醇作用于人胰腺癌细胞株Panc02，通过高迁移率族蛋白(HMGB1)与模式识别受体RAGE结合诱导Beclin1依赖性自噬。Hayashi[31]报道，紫杉醇诱导人主动脉内皮细胞自噬可能与P53上调、Bcl-2和ERK下调有关。还有研究发现，紫杉醇通过Cdx1-Bcl-2-LC3途径诱导结肠癌干细胞发生自噬，通过MAPK途径诱导FLCN缺失的肾癌细胞自噬[25，32]。可见，紫杉醇可通过多种途径诱导自噬，诱导的途径因细胞类型而异。

三、调整自噬增加紫杉醇敏感性

根据自噬和抗肿瘤药物间的关系，许多研究探索针对自噬进行抗肿瘤治疗。针对肿瘤细胞的保护性自噬，可通过抑制自噬增加肿瘤放化学治疗敏感性。例如，酪氨酸激酶抑制剂治疗慢性骨髓性白血病，常出现耐药[33]。研究发现，伊马替尼可剂量依赖性地诱导自噬发生，将伊马替尼和自噬抑制剂氯喹联合作用于慢性骨髄性白血病细胞明显增加了肿瘤细胞死亡率[34]。又有研究发现，曲妥珠单抗可诱导HER2阳性的乳腺癌细胞自噬导致细胞耐药，shRNA抑制LC3表达可增加药物的敏感性[35]。在胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中，都进行了自噬抑制药物与目前抗肿瘤治疗联合治疗的研究[36]。目前经常使用的自噬抑制剂包括：①3-MA，抑制Ⅲ型PI3K 活性；②氯喹、羟氯喹，通过改变溶酶体的pH 值抑制自噬小体和溶酶体融合；③巴弗洛霉素A1，通过抑制自噬溶酶体内H+-ATPase 的活性，抑制自噬溶酶体的降解；④siRNA，抑制相应Atg 表达。此外，针对细胞过度自噬可导致自噬性死亡的特点，不少研究通过上调肿瘤细胞自噬活性促进死亡。有报道，替莫唑胺可通过促进自噬杀死有凋亡抗性的恶性胶质瘤细胞[37]。抗肿瘤药物XK469及其类似物SH80可通过诱发自噬杀死对多种抗癌药物耐药的白血病L1210 细胞，并使细胞生长停滞在G2/M 期[38]。在白血病体内试验中,mTOR特异性抑制剂依维莫司通过诱导过度自噬有效地缩小肿瘤体积[39]。

目前，已有研究探索通过调整自噬提高肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性，改进紫杉醇的临床疗效。有研究发现，通过抑癌基因ARHI再表达上调自噬水平可增强紫杉醇对乳腺癌细胞的抑制作用[40]。联合应用紫杉醇和自噬抑制剂羟氯喹治疗小细胞肺癌正在进行临床试验(http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=autophagy)。

四、 结 语

细胞自噬是在生理条件和病理条件下普遍存在的生理机制，紫杉醇在多个肿瘤细胞株中诱导自噬，其诱导的自噬抑制或促进凋亡，作用机制尚未明确，对其深入研究有望实现通过调整自噬增加肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性。

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