链霉菌产生的抗血栓活性物质研究进展

杜迎翔，贺丽英，程广艳，孔 毅*(.中国药科大学分析化学教研室，南京 0009；.中国药科大学生命科学与技术学院，南京 0009)

急性心肌梗死、高血压、冠心病、先天性心脏疾病和心脏衰竭等心血管疾病是造成全球人口死亡的主要原因之一[1]。世界卫生组织(WHO)预测，截止到2030年，每年将会有2 300万人死于心血管疾病[2]。早在1980年，De Wood采用链激酶静脉滴注的方法治疗早期的急性心肌梗死，从而降低了急性心肌梗死患者的死亡率，确立了溶栓药物在心血管疾病治疗中的地位[3]。

临床所使用的溶栓药物具有价格昂贵、较低的纤维蛋白特异性、半衰期较短、伴随出血危险、易引发变态反应等缺点[4-6]，因此亟待开发更加安全有效的新型抗血栓药物。目前研究人员主要进行两方面的工作，一方面是利用基因工程和单克隆抗体技术对现有的抗血栓药物进行改造，降低其产生的不良反应，使其达到更好的临床应用效果；另一方面是筛选新型的天然来源的溶栓药物。微生物种类繁多，生长周期短，易于大量培养，其代谢产物结构多样，生物活性丰富。因此，微生物来源的抗血栓活性物质具有极高的研究价值。本文对来源于链霉菌的抗血栓活性物质进行了简单地综述。

1 血栓形成的机制

血栓是血液流动的过程中，在血管或心脏内膜的表面形成的一种病理性的、非均匀性的半凝块状物质，它的主要成分是纤维蛋白[7]。人体血液中存在相互拮抗的凝血系统和抗凝血系统(也称纤维蛋白溶解系统)，当纤维蛋白溶解系统的功能降低时，凝血与抗凝血功能就会失去平衡，引起血栓形成[8]。

2 抗血栓药物

目前，临床上常用于血栓性疾病防治的药物主要为抗血小板类药物、抗凝血类药物和溶血栓药物[9]，前两类药物用于防治动静脉血栓的形成，后一类用于溶解血栓。

在哺乳动物血液中存在担当溶解血栓作用的纤溶系统，纤溶过程包括2个基本过程：其一是在纤溶酶原激活剂(PA)的作用下，纤溶酶原(Pg)转变成纤溶酶(Pm)，纤溶酶可以将血凝块上的不溶性纤维蛋白降解为可溶性的产物，从而溶解血栓；其二是纤溶酶直接作用于纤维蛋白(原)，使其降解，溶解血栓。目前，临床上常用的溶栓药物主要为纤溶酶原激活剂，如链激酶(SK)、尿激酶(UK)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等[10]。

3 从链霉菌中发现的抗血栓活性物质

链霉菌属于放线菌目的一科，是一类在自然界中广泛存在的微生物，多见于土壤中。绝大多数的链霉菌对人体是无害的，大部分链霉菌能够分泌多种蛋白质(如蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等)，大多数抗生素也是由链霉菌产生的，在放线菌产生的生物活性物质中，以链霉菌属居首，高达8 366余种[11]。

已报道的从链霉菌中发现的抗血栓活性物质大部分为溶栓剂。从作用机制上微生物来源的溶栓剂分为两类：一类是纤溶酶原激活剂，如链激酶(SK)、葡激酶(SaK)，其作用机制是激活纤溶酶原转变为纤溶酶，纤溶酶具有丝氨酸蛋白酶的活性，可以降解构成血栓骨架的纤维蛋白，起到溶解血栓的作用；另一类是纤溶酶类物质，其机制是直接作用于血块中的纤维蛋白(原)，使血栓溶解，来源于芽孢枯草杆菌的纳豆激酶[12](NK)以及来源于链霉菌、芽孢杆菌、粪链球菌、镰刀菌等的纤溶活性物质的作用机制多属于此类。

3.1链霉菌产生的抗凝活性物质 刘华珍等[13]从链霉菌S-254发酵液中筛选了一种凝血酶抑制剂，为多组分小肽化合物，其组成结构为R-X-X-Argininal，X为氨基酸残基，R为丙酰基或丁酰基，是一种能直接作用于人体凝血机制中最关键的酶——人凝血酶的抗凝活性物，与有关的抗凝剂相比，S-254凝血酶抑制剂的活性更强。S-254对人凝血酶显示出的明显抑制作用不仅体现在体外实验中，在动物体内也显示出良好的抗凝血、抗血栓形成和抗血小板聚集的作用，此研究将为深入研究凝血酶提供有利的途径并在实际的应用中开拓出新的前景。

3.2链霉菌产生的溶栓活性物质 人血液中存在的纤溶酶和纤溶酶原激活剂都是丝氨酸类蛋白酶，而链霉菌分泌产生的多种活性蛋白酶中，很多也属于丝氨酸类蛋白酶家族，所以从链霉菌中筛选新型的天然来源的抗血栓药物具有诱人的前景。1996年，法国科学家报道了一种从链霉菌的发酵液中分离纯化到的具有纤溶活性的蛋白酶[14]，之后陆续有研究人员从链霉菌中发现新的具有纤溶活性的蛋白酶。

3.2.1链霉菌产生的具有纤溶酶活性的物质 王骏等[15]报道了从一株云南土壤筛选出的链霉菌Y405的发酵液中获得了一种具有纤溶活性的蛋白酶SW-1。SW-1是单肽链蛋白，相对分子质量为30 kDa，等电点为8.5，其纤溶活性在4～37 ℃、pH4.0～9.0具有较好的稳定性，最适pH为8.0。该酶对丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和金属离子螯合剂EDTA都较为敏感，N端17个氨基酸序列为R/N/F-P/D-G-M-T-M-T-A-I-A-N-Q-N-T-Q-I-N-，N端第一和第二残基具有不均一性。SW-1是一种纤溶酶，可以直接降解纤维蛋白和纤维蛋白原，但其对纤维蛋白的特异性不高，可能引起系统性纤溶，造成其在使用上具有一定的局限性，目前研究人员正在利用基因工程的方法改造相应的基因sqr-1。

Chitte R R等[16]从一株嗜热链霉菌SD5发酵液中纯化出一种强纤维蛋白特异性的纤溶酶actinokinase，该酶产生的最佳pH为8.0，温度为55 ℃。actinokinase为丝氨酸蛋白酶，纤溶活性具有N端依赖性，相对分子质量为35 kDa，在37～60 ℃、pH6～9范围内，它的纤溶活性都比较稳定。actinokinase能够直接把纤维蛋白降解为小分子产物，与链激酶和尿激酶相比，actinokinase能够快速溶解血凝块。actinokinase基因已在大肠杆菌中进行了克隆和表达，美国和印度专利局对利用嗜热链霉菌SD5和它的突变体产生纤溶酶的过程授予了专利[17]，actinokinase可能会成为一种有前景的治疗心肌梗死的药物。

鞠秀云等[18]从链霉菌XZNUM00004发酵液中分离纯化到纤溶酶SFE1，SDS-PAGE电泳显示，该酶的相对分子质量为20 kDa，在pH5～8和低于65 ℃条件下稳定，最适宜pH和最适温度分别为7.8和35 ℃，N端15个氨基酸序列为A-P-I-T-L-S-Q-G-H-V-D-V-V-D-I-。SFE1纤溶酶活性高，同时具有耐热的优点，将酶加热到65 ℃仍能保留85%的活性。PMSF可以强烈抑制SFE1的活性，表明该酶属于丝氨酸类蛋白酶，EDTA和EGTA能够部分抑制其活性。SFE1能够首先快速水解纤维蛋白原的Aα-链，紧接着水解Bβ-和γ-链。该酶对研究从链霉菌中得到新型高效的溶栓药物是一个有益的探索。

Mander P和Simkhada J R等[19-21]分别从3株链霉菌菌株CS624、CS684和CS628发酵液中纯化得到3种单肽链纤溶酶FES624、FP84和FP28。这3种蛋白酶N端的15个氨基酸序列各不相同，是3种不同的纤溶酶。其中FP28是目前为止报道的链霉菌产生的相对分子质量最小的纤溶酶，其相对分子质量为17.6 kDa。FES624相对分子质量与FP28相近，为18 kDa，两者的N端氨基酸序列有33%相同，但纤维蛋白平板实验表明，FP28的活性比FES624好。FP28与FP84(35KDa)相对分子质量相差较大，两者均可降解纤维蛋白原，但FP84只能水解纤维蛋白原的Bβ-链，而FP28可以在2 h内水解纤维蛋白原的3条链Aα-、Bβ-和γ-。体外动物实验表明，FP28具有很好的抗血栓活性，在未来可能会成为一种有前景的溶栓药物。

蔡尤佳[22]研究表明，一株嗜酸放线菌701的发酵液具有较强的抗凝、溶栓活性，嗜酸放线菌属于放线菌中的链霉菌属。对该菌株的发酵条件进行优化，提高了发酵液的溶栓活性，为开发新型的血栓防治药物的扩大工艺研究提供了参考。

3.2.2链霉菌产生的同时具有纤溶酶活性和纤溶酶原激活剂活性的物质 Uesugi Y等[23]从链霉菌中发现了一种高活性的丝氨酸蛋白酶SOT，与已知的纤溶酶和纤溶酶原激活剂等相比，SOT具有很高的纤溶活性。体外实验结果表明，SOT的纤溶活性是纤溶酶的18倍，纤维蛋白平板实验结果显示，SOT的活性可与t-PA相媲美，SOT也具有纤溶酶原激活剂活性。与纳豆激酶相比，SOT能够迅速水解纤维蛋白原的Aα-和Bβ-链，两者对纤维蛋白和纤维蛋白原降解模式各不相同，但具有纤溶协同效应。研究表明，SOT可作为一种有效的溶栓剂用来预防和治疗血栓。

武临专等[24]对链霉菌C-3662的发酵上清液进行分离纯化，得到了一种具有纤溶活性的蛋白酶CGW-3。CGW-3为一单肽链蛋白，相对分子质量22.72 kDa，等电点为9.0，纤溶活性的最适pH为7.5～8.0，对温度比较敏感。该酶对丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF敏感，对EDTA不敏感；其N端15个氨基酸的序列为V-V-G-G-T-R-A-A-Q-G-E-F-P-F-M-，与微生物来源的胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶具有较高的同源性。CGW-3具有纤溶酶活性，可以直接降解纤维蛋白，也可以作为纤溶酶原激活剂，起到溶解血栓的作用。初步动物实验结果表明，在大鼠体内蛋白酶CGW-3的溶栓效果要优于尿激酶。

4 结语

近年来，随着对血栓疾病的深入研究，寻找和研制效果好、不良反应小的抗血栓药物对人类健康具有十分重要的意义。目前报道的从链霉菌中发现的丝氨酸类蛋白酶，其活性与临床上使用的溶栓药物相比，具有很大的优越性，而且链霉菌的生长速度快，生长条件易于控制，可以通过控制人工发酵条件对目的产物进行批量生产。综上所述，对从链霉菌中发现的抗血栓活性物质的进一步研究，将会使临床使用这类溶栓剂具有广阔的前景。

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