高胰岛素血症对平滑肌细胞基因异常甲基化的作用研究进展

仲伟天 综述 王旭开 审校

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管内科，重庆 400042)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)常伴有胰岛素抵抗，胰岛素抵抗首次由Himsworth 提出，是指机体对胰岛素不敏感，从而影响血糖的代谢，这时机体为了维持一个较正常的血糖水平，通过自我调节机制使其胰岛β 细胞分泌较正常多几倍甚至十几倍的胰岛素来降低血糖，这便造成了高胰岛素血症。20世纪70 年代de Fronzo 等发展了葡萄糖胰岛素钳夹技术，此技术迄今仍为世界公认在体内定量而准确测定胰岛素敏感性的金标准方法，当空腹或餐后胰岛素峰值大于正常人均值+2 倍标准差(一般为空腹胰岛素＞15 mU/L，或/及餐后＞80 mU/L)时，可诊断为高胰岛素血症［1］。

高胰岛素血症是冠心病、高血压、高血脂、T2DM、肥胖、脑卒中等共同的发病基础。目前越来越多的数据证实高胰岛素血症是导致动脉粥样硬化的重要因素之一，主要机制是高胰岛素血症导致血管平滑肌细胞表型转化。世系追踪研究提出确切证据，成年动物的血管平滑肌细胞保持显著的可塑性［2-3］，当遭遇血管损伤、细胞因子、生长因子或者疾病时可以进行可逆的表型转化［4-6］，由收缩表型转化为合成分泌表型。这种可塑性的危害在于其表型转化受到环境因素的影响，有许多证据证实平滑肌细胞的表型转换在多种疾病中至关重要，例如动脉粥样硬化、哮喘、高血压等。

1 血管平滑肌细胞异常甲基化与动脉粥样硬化

有研究证实表观遗传改变是平滑肌细胞表型转化的重要原因之一，主要表现为CpG 岛(CpG island)的DNA 甲基化和组蛋白的乙酰化。暴露于有害的环境或者有害的因子也许可以使导致内膜功能损伤和动脉粥样硬化的氧化剂和炎性基因的表观遗传改变。

表观遗传学通常被定义为DNA 的序列不发生改变但是基因表达却发生了可遗传的改变，也就是说基因型未改变而表型却发生了改变，这种变化是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质的改变，并且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定地传递下去，主要有甲基化和乙酰化等。与DNA 序列的改变不同的是，许多表观遗传的改变是可逆的，这使表观遗传疾病的治愈成为可能。

有关动脉粥样硬化的DNA 异常甲基化的报道最早在1999 年出现，近年来，心血管疾病被认为是受甲基化控制的人类重要疾病:(1)即使在相同家族或遗传背景下，其发病也不可预测;(2)出生前的影响，包括母系食谱、胎儿营养及其他出生前环境的改变，均成为子代成年后疾病发生的重要诱因;(3)随年龄增加而使疾病发生风险上升［7］。

最近有学者提出染色质的动态变化也许影响了糖尿病导致的血管病变［8］，而DNA 的甲基化可以改变染色质的构象，使染色质浓缩成非活性的高级结构。组蛋白乙酰化修饰对动脉粥样硬化的调控至关重要，包括血管平滑肌细胞分化、内皮细胞增殖和炎性通路［9］，但是很少有研究关于DNA 甲基化改变与动脉粥样硬化的关系，目前已知的至少部分作用于动脉粥样硬化与甲基化有关的基因有干扰素γ38、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)A39，一些金属蛋白酶类、金属蛋白酶类组织抑制因子、胞内黏附分子、雌激素受体α(estrogen receptor α，ERα)、胞外超氧化物歧化酶、p53 等。

Seppo 等研究发现在动脉粥样硬化患者和载脂蛋白E 敲除小鼠的斑块处，基因中的5-甲基胞嘧啶的含量显著降低，平滑肌细胞在从收缩表型向分泌表型转化的过程中表现出低甲基化，并且与转录活性增强相关，但是实验中发现甲基转移酶表达增加，多个实验证实，当在试验中加入甲基化抑制剂脱氧氮杂胞苷后，平滑肌细胞的收缩表型标志增加，提高了细胞的收缩性［10］。由此怀疑在血管平滑肌细胞表型转化导致动脉粥样硬化过程中可能同时存在特异位点的异常甲基化以及去甲基化，表观遗传改变在平滑肌细胞分化以及在血管损伤或者动脉粥样硬化表型转化去分化时发挥重要作用［11］。

1.1 PDGF 低甲基化与动脉粥样硬化

PDGF 是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力。高浓度胰岛素可激活丝裂原活化蛋白激酶信号转导系统，使内皮细胞释放PDGF 损伤内皮细胞功能导致脂质沉积，引起动脉粥样硬化，同时促使血管平滑肌细胞增殖［12］。实验证明在胶质细胞瘤中，原癌基因PDGF-B 启动子序列是未甲基化，促进细胞分裂增殖［13］，且在动脉粥样硬化患者的内膜中发现其表达。在致动脉粥样硬化过程中，有研究发现，高同型半胱氨酸血症可以使内皮细胞PDGF-A、C、D 去甲基化，导致内皮功能紊乱并激活血管平滑肌细胞促使动脉粥样硬化的发生［14］。

1.2 ERα 高甲基化与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化过程同时也伴随着DNA 高甲基化现象，人类ERα 与动脉粥样硬化和其他血管疾病密切相关。正常ERα 除了发挥抑制生长作用外，还会与雌激素反应，产生有保护作用的一氧化氮(NO)，抑制平滑肌细胞增殖和血小板激活。在动脉粥样硬化过程中，ERα 基因甲基化程度提高，导致其抑制生长的作用减弱，从而加重血管平滑肌细胞的增殖。雌激素可以通过Ras/PI3K/Akt 通路诱导凋亡相关蛋白BAD(Bcl-xl/Bcl-a-associated death promoter)的磷酸化，抵抗肿瘤坏死因子、超氧化物等因素诱导凋亡的过程。

在各种肿瘤细胞中都发现ERα 基因存在高甲基化。1999 年Wendy 等证实ERα 的甲基化与动脉粥样硬化有关，其发现与斑块周围正常的细胞相比，斑块处细胞的ERα 表现出高甲基化。特别是内膜细胞ERα 表现出低甲基化，而血管平滑肌细胞表现出高甲基化［15］，且在血管平滑肌细胞表型转化时发现ERα甲基化程度增加［16］，也说明血管平滑肌细胞在致动脉粥样硬化过程中的重要作用。

1.3 p53 高甲基化与动脉粥样硬化

p53 在调节细胞生长周期中具有重要作用，通过促使p21 的转录抑制G1 期多种酶复合物的激活，作为一个肿瘤抑制基因，p53 有抗增殖和促凋亡作用，其甲基化可能导致动脉粥样硬化的发生。研究发现p53及载脂蛋白E 基因敲除小鼠的后代，在高脂喂食的第6、10、15 周的动脉粥样硬化区域比p53 基因未敲除小鼠后代的损伤区域明显增加50%～100%［17］，Rodríguez-Campos 等［18］研究发现，早期的血管平滑肌细胞从中膜迁移需要抑制p53 基因的表达，两实验说明p53 通过抑制细胞增殖来抵抗动脉粥样硬化的作用。但究竟是通过什么途径来抑制p53 基因，并没有确切的说明。由于p53 基因在肿瘤方面的研究，怀疑是通过某种甲基化途径导致的抑制。

2 高胰岛素血症对平滑肌细胞异常甲基化的作用机制

DNA 甲基化主要通过将S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在DNA 甲基转移酶作用下，将CpG 岛二核苷酸中的胞嘧啶环上5'位置的氢取代，从而转变成5-甲基胞嘧啶。在哺乳动物中最主要的DNA 甲基转移酶是甲基转移酶1、甲基转移酶3a 和甲基转移酶3b。其中甲基转移酶3a 和3b 能在未发生甲基化的DNA 双链上进行甲基化，不需要模板链的指导。甲基转移酶1 在模板链的指导下，使半甲基化的DNA 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。

DNA 脱甲基化不是一种酶的作用，可能通过5-甲基脱氧胞嘧啶脱氨基转化为胸腺嘧啶或通过5 位碳的氧化作用，生成5-羟甲基脱氧胞嘧啶，进一步氧化生成甲酰胞嘧啶和羧基胞嘧啶或直接脱氨基形成5-羟甲基尿嘧啶［19］。所有这些中间体都能触发碱基切除修复通路并且被未甲基化的胞嘧啶替换，从而脱甲基化。

最近有研究发现，表观遗传的改变可能与氧化压力和环境因素有关，体内实验证明重金属、过氧化物酶体、空气污染、生殖毒性物质是重要危险因素［20-21］。有趣的是高胰岛素血症使NO 的活性和活性氧族的平衡失调，活性氧族使NO 迅速形成过氧硝酸基，而过氧硝酸基是一种有力的氧化剂，并且实验证实胰岛素抵抗导致血管平滑肌细胞表型转化［22］。高胰岛素导致甲基化的作用也被证实，如Kim 等［23］通过对雄激素受体启动子研究发现，胰岛素抵抗使阴茎海绵体平滑肌细胞雄激素受体启动子甲基化，抑制了雄激素受体的表达，导致T2DM 患者常伴有勃起功能障碍。由于基因表观遗传改变可以通过不同的调控机制完成，由此提出假设，胰岛素抵抗导致血管平滑肌细胞表型转化可能是通过使细胞表观遗传改变实现的。

至于高胰岛素血症具体是通过何种途径导致平滑肌细胞基因异常甲基化现在还存在许多未知。有研究发现，高半胱氨酸可以抑制平滑肌细胞甲基化，因为高半胱氨酸抑制了甲基化供体赖以产生的叶酸和维生素B12依赖的甲硫丁氨酸-S-腺蛋氨酸转化过程。也有研究发现T2DM 体内存在组蛋白甲基化酶SET7/9 和组蛋白去甲基化酶LSDl 表达失调，进而激活炎症基因核转录因子κB 可能是糖尿病大血管并发症发生发展的重要表观遗传机制。高胰岛素导致平滑肌细胞的异常甲基化的作用机制需要进一步研究。

3 问题与展望

表观遗传改变、高胰岛素血症导致血管平滑肌细胞表型转化已经逐渐被证实，高胰岛素血症使平滑肌细胞基因异常甲基化也被发现，但两者导致平滑肌细胞表型转化的过程中，是否存在某种联系尚未见到报道，由于基因表观遗传改变受多种因素影响，所以证实高胰岛素血症使基因甲基化改变从而导致血管平滑肌细胞表型转化的研究显得尤为重要。其中存在许多问题，如基因异常甲基化如何导致动脉粥样硬化的发生，高胰岛素如何导致基因异常甲基化，到目前为止只看到了结果，没发现其作用的具体过程。

多种实验证实，平滑肌细胞表型转化过程中同时存在基因低甲基化与高甲基化，说明其表型转化是多种基因共同作用的结果，这为后续确定胰岛素导致哪些基因异常甲基化，以及哪些基因异常甲基化是导致血管平滑肌细胞表型转化的主要因素的研究带来困难，到目前为止这些基因仍然在不断地被发现，最近日本学者通过对T2DM 患者粥样斑块周围细胞的全基因组关联分析研究，发现与动脉粥样硬化有关的新的基因，其中丝裂原活化蛋白激酶4、E 盒结合锌指蛋白1、蛋白激酶FYN 基因较正常细胞高甲基化，而头套同源物、早期B 细胞因子1、核苷酸结合寡聚化结构域基因较正常细胞低甲基化［24］。国际人类表观遗传学合作组织计划在10 年内绘制1 000 个参考表观遗传基因［25］，将会对T2DM 患者是否发生血管病变进行表观遗传分析提供充足的参考，但是从众多候选基因中，挑选出目的基因是一个艰巨的工作。

人们对心血管疾病的DNA 甲基化调控机制研究正在不断深入，尽管高胰岛素导致平滑肌细胞基因异常甲基化的研究还在初级阶段，但是这些研究有助于了解平滑肌细胞表型转化的新机制，随着研究的不断深入，将有利于为T2DM 并发动脉粥样硬化患者提供更好的临床治疗。

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