玉米秸秆水解液发酵产琥珀酸的条件优化研究

谢慧，张兆昆，吴琼，王风芹，任天宝，宋安东*

（1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002；2.河南农业大学烟草学院，河南郑州450002）

玉米秸秆水解液发酵产琥珀酸的条件优化研究

谢慧1，张兆昆1，吴琼1，王风芹1，任天宝2，宋安东1*

（1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002；2.河南农业大学烟草学院，河南郑州450002）

以玉米秸秆水解液为原料，对一株产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）ATCC 55618的发酵条件进行优化，研究了培养温度、发酵培养基的初始pH以及培养基成分对该菌株产琥珀酸发酵的影响，并利用响应面法（RSM）对发酵培养基中的水解糖、玉米浆和Na2CO3添加量3个主要因素进行优化，经过优化后的发酵条件为培养温度37℃、培养基初始pH6.8；水解糖质量浓度60g/L、玉米浆质量浓度10g/L、Na2CO3（10mol/L）添加量2mL。在1L的厌氧甁中进行了分批发酵放大实验，琥珀酸产量最高达19.66g/L。

玉米秸秆；水解液；琥珀酸；条件优化；响应面法

琥珀酸学名丁二酸，是一种广泛存在于人体、动植物和微生物体内常见的天然有机酸。琥珀酸是三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）的中间产物之一，在生物的代谢中占有非常重要的地位，因此被广泛用于化学药物的中间体[1]。琥珀酸也被公认为将是继柠檬酸和乳酸后的下一个大规模生产的有机酸产品[2]。传统的琥珀酸生产方法主要是依赖化石原料通过化学过程来合成琥珀酸。然而，随着能源危机的日益严重，新兴的发酵法生产琥珀酸以其低能耗、高环保性和原料的可持续利用性而受到越来越多科学家的重视。

我国拥有丰富的植物纤维资源（如农作物秸秆、林产品加工业下脚料等），每年仅玉米秸秆一项就超过1.7亿t[3]。每年浪费或低利用的纤维材料总共约10亿t，其中农作物秸秆一项大约7亿t[4]，这些纤维质原料（如玉米秸秆、玉米籽皮、玉米芯等）可以利用物理或化学的预处理方法破坏纤维质原料的内部结构降低其聚合度；再加入水解酶或能产生水解酶的微生物使纤维质原料转化为低分子糖类如葡萄糖和木糖等，最后利用微生物发酵大规模的转化制备琥珀酸等生物基化工产品，产业前景十分广阔[5]。因此，利用农作物秸秆水解液作碳源制备琥珀酸，将有效减少琥珀酸发酵对淀粉原料的依赖性，缓解当前面临的粮食危机问题，并可降低原料成本[6]。

目前，琥珀酸发酵的研究主要集中在菌种选育和代谢调控等方面。关于琥珀酸发酵条件优化方面的研究较少，尤其是以纤维水解液为原料发酵产琥珀酸的条件研究则更少，因此，本研究也为实现以农作物秸秆水解液为原料发酵生产琥珀酸的产业化提供一定的参考条件和技术支撑。文中研究利用水解糖质量浓度为39.99g/L（葡萄糖质量浓度为19.07g/L、木糖质量浓度为20.82g/L）的玉米秸秆水解液作原料，在300mL厌氧甁中对一株产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）ATCC 55618首先进行了培养温度、发酵培养基初始pH值及发酵培养及成分的条件优化；为进一步提高琥珀酸产量，又利用响应面法优化琥珀酸发酵培养基中的3个主要因素；并利用优化后的发酵条件在1L的厌氧甁中进行分批发酵放大试验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

玉米秸秆：取自河南省新乡，粉碎至10目，经检测其成分为纤维素32.56%，半纤维素20.64%，木质素11.95%，水分4.41%，灰分3.22%[17]。

1.1.2 试剂

纤维素酶（滤纸酶活260U/mL）和木聚糖酶（10 000U/mL）：杰能科（中国）生物工程有限公司；酵母膏、玉米浆均为工业级；发酵试验所用的试剂均为市售色谱纯或分析纯。

1.1.3 菌种

菌种：产琥珀酸放线杆菌（A.succinogenes），保存号ATCC 55618，购自中国工业菌种保藏中心（CICC）。

1.1.4 培养基

种子培养基：葡萄糖2.5g、K2HPO4·3H2O 2.5g、胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、NaCl 5g、pH 7.0加水定容至1L。

发酵培养基：玉米秸秆水解液（水解糖质量浓度为40g/L）、玉米浆15g/L、富马酸二钠1g/L、K2HPO43g/L、NaCl 1g/L、MgCl20.2g/L、CaCl20.2g/L、NaH2PO4·H2O 1.6g/L、Na2HPO40.31g/L[6]。

1.2 仪器与设备

JYS-1000全自动高压蒸气灭菌锅：上海申安医疗器械厂；722S可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；P680 HPLC高效液相色谱仪：美国戴安公司；Aminex HPX-87H色谱柱：美国Bio-Red公司。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

将处于生长对数期的种子液以5%的接种量在厌氧条件下接入装有90mL培养基的300mL厌氧甁中，再充入250mLCO2（纯度99.99%）气体，并用封口膜密封保证厌氧环境，置于37℃摇床中150r/min培养。

1.3.2 检测方法

发酵液在室温条件下10 000r/min离心10min，取上清，用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤。利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测发酵底物与产物含量，色谱柱为HPX-87H（美国Bio-Red公司），流动相为5mmol/L的H2SO4溶液，流速为0.6mL/min，柱温55℃，进样量10μL，检测器为视差折光（refractive index，RI）检测器。菌体密度利用可见分光光度计于波长660nm处测定其吸光度值。结果均为平行测定3次后的平均值。

2 结果与分析

2.1 发酵环境条件优化

2.1.1 培养温度对琥珀酸发酵的影响

温度对细胞生长和产物合成过程具有重要影响，而且细胞生长和产物合成的最适温度不一定相同，因此，在发酵过程中需要选择合适的培养温度，分别在33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃条件下进行培养，结果如图1所示。

图1 培养温度对菌体生长和产酸的影响Fig.1 Effect of incubation temperature on cell growth and succinate production

由图1可知，当培养温度低于37℃时，琥珀酸的产量随温度升高而升高，当培养温度高于37℃，琥珀酸的产量随温度的升高而减小。当培养温度为37℃时，菌体OD660nm最高，琥珀酸产量也达到最高8.42g/L，37℃是适宜的培养温度。

2.1.2 培养基的初始pH对琥珀酸发酵的影响

城市交通智能化发展必须要遵循现有的城市化交通发展战略，顶层的设计是城市交通朝向智能化发展的关键环节，顶层的设计是解决城市智能化发展的首要目标和重要任务[4]。因此，城市交通智能化发展在大数据时代下首先要充分利用互联网等最新信息技术，以人工智能、综合感知和普适计算作为支撑基点，实现城市发展和城市智能交通的双面结合，对人群所需和其他活动于物流做出智能反应，保障城市平衡发展。另外，还要寻求理论与技术创新使用于一体，主要着眼于建设决策者、系统服务对象等其他交通参与者的设定，并且对各类主体参与者的特征和参与者的空间分布进行有效性研究，达到城市空间与智能交通运营相互关联。

微生物生长和生物合成都有其最适pH和能够耐受的pH范围。过高或过低的pH还会影响菌体的形态，同时对某些微生物的合成代谢途径也有一定影响，从而影响发酵效果。因此，选择合适的发酵培养基的初始pH值对产琥珀酸放线杆菌发酵产琥珀酸至关重要。用pH值为5.8和7.9，浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲液将发酵培养基的pH值分别设定6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4六个水平来进行发酵培养，考察不同培养基初始pH对琥珀酸发酵的影响，结果如图2所示。

图2 初始pH对菌体生长和产酸的影响Fig.2 Effect of initial pH on cell growth and succinate production

由图2可知，当培养基的初始pH值为6.8时，琥珀酸的产量最高，为8.75g/L，且菌体生长较好，pH过高或过低都会影响琥珀酸的产量。故选择pH 6.8为培养基的初始pH。

2.2 琥珀酸发酵培养基主要因素优化

2.2.1 水解糖质量浓度对琥珀酸发酵的影响

玉米秸秆水解液中的纤维水解糖是产琥珀酸放线杆菌发酵培养基的主要碳源，因此，其在培养基中的质量浓度非常重要，如果底物水解糖的质量浓度过高，细胞生长会因细胞脱水而下降，并在某一质量浓度下会阻遏1个或更多的影响产物合成的关键酶。此外，水解糖的质量浓度也会对琥珀酸的发酵周期产生一定影响。根据目前文献报道，通常琥珀酸发酵的水解糖浓度一般在40g/L左右，因此，将水解糖质量浓度为70g/L的水解液依次稀释为20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L和70g/L六个水平，并以此为原料分别发酵产琥珀酸来考察不同水解糖的质量浓度对琥珀酸发酵产量的影响，对比结果如图3所示。

图3 不同水解糖质量浓度对菌体生长和产酸的影响Fig.3 Effect of different hydrolyzate concentration on cell growth and succinate production

由图3可知，当培养基中水解糖质量浓度高于60g/L时，琥珀酸产量减小，说明高于此质量浓度的水解糖对琥珀酸的合成可产生抑制作用，OD660nm值的变化也是如此。而当水解糖质量浓度为60g/L时，琥珀酸产量达到15.84g/L，为水解糖的最佳质量浓度。

2.2.2 玉米浆质量浓度对琥珀酸发酵的影响

玉米浆是产琥珀酸放线杆菌生长所依赖的主要氮源，且具备价格低廉和营养丰富等优点，同时也是工业上常用的有机氮源，在有关琥珀酸发酵的相关文献报道中，玉米浆的应用也较为广泛。当玉米浆作为氮源时，若质量浓度过小，会造成菌体生长缓慢，从而影响产物的产率；若质量浓度过大，会造成菌体生长旺盛，使养分过早耗尽，导致菌体提前衰老，从而缩短产物的生产期。因此需要选择合适的玉米浆质量浓度，分别设定玉米浆的初始添加质量浓度为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L和30g/L共六个水平发酵产琥珀酸，来考察不同玉米浆添加量对琥珀酸产量的影响，对比结果如图4所示。

图4 不同玉米浆质量浓度对菌体生长和产酸的影响Fig.4 Effect of different corn syrup concentration on cell growth and succinate production

由图4可知，当玉米浆的添加量为10g/L，琥珀酸的产量为最高值8.33g/L。玉米浆的添加量高于或低于10g/L时，琥珀酸的产量会降低。故玉米浆的添加量为10g/L时最合适。

以生物发酵法制备琥珀酸，CO2、pH是影响菌体生长和琥珀酸产量的关键因素[7]。CO2在菌体的生长代谢过程中可作碳源被菌体利用，合成琥珀酸。环境pH的改变不仅会引起菌体内外部化学环境和酶活力的变化，对细胞代谢产生影响，而且还可以影响CO2的溶解水平，以及、的解离平衡，进而影响琥珀酸的合成。因此，在琥珀酸发酵过程中维持pH在适宜的范围，对提高菌体的代谢活性和产琥珀酸能力具有重要作用。

产琥珀酸放线杆菌发酵产琥珀酸过程中产生的有机酸可使pH值明显下降。为了维持发酵液中的pH在一定范围内，可加入碳酸盐作为酸碱中和剂。同时，碳酸盐还可以提供一定的，并与发酵过程中产生的有机酸反应而释放出CO2来维持琥珀酸发酵所需的CO2环境。另外，pH调节剂中的金属阳离子在维持细胞新陈代谢方面起着重要作用。因此，选取添加量2.0mL Na2CO3、NH4HCO3、MgCO3、K2CO3、CaCO3这五种文献报道较多且应用较广的碳酸盐（浓度均为10mol/L）作为pH调节剂。通过在发酵12h、18h、24h、30h产琥珀酸放线杆菌代谢较旺盛的发酵时间点均添加以上5种碳酸盐，来分别对比考察了这5种不同pH调节剂对琥珀酸产量的影响，结果对比如图5和图6所示。

由图5可知，5种碳酸盐中Na2CO3的发酵产量最高，NH4HCO3和CaCO3的发酵产量相对较低，这可能是由于细胞膜对有较高的通透性，+的渗入会造成胞内pH水平发生变化，细胞需要更多的能量将泵出，可见，环境中较高浓度会降低细胞对能量的利用效率。当能量供给不足时，受胞内的影响，胞内的pH发生变化，影响细胞正常的生长代谢[8]，同时，由于CaCO3的溶解能力差，因此少量的CaCO3很难将pH维持在适合菌体生长的范围。同时，已有研究表明，Ca2+对琥珀酸生产菌Mannheimiasucciniciproducens具有毒害作用[9]。同时，高浓度的Ca2+可以改变细胞膜正常的流动性和通透性，致使菌体不能进行正常的胞内外物质能量传递，从而影响产琥珀酸放线杆菌的正常生长和代谢。此外，Mg2+在维持细胞新陈代谢方面起着重要作用，Mg2+是许多酶的激活剂，在琥珀酸合成途径中的关键酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶）的辅助因子，对代谢流的分布起着关键的作用。因此，琥珀酸产量也整体相对较高。但是MgCO3成本较高，且会增加下游产品分离提取的难度，不利于生物法制备琥珀酸的产业化。

图5 不同pH调节剂对琥珀酸发酵产量的影响Fig.5 Effect of different pH modifier concentration on succinate production

图6 不同Na2CO3添加量对琥珀酸发酵产量的影响Fig.6 Effect of different Na2CO3addition on succinate production

由图6可知，在发酵过程中当培养基的Na2CO3（浓度为10mol/L）添加量为2mL时，琥珀酸产量最高，Na2CO3可以提供CO32-，且可以调节发酵过程的pH，有利于产琥珀酸放线杆菌合成琥珀酸。当Na2CO3添加量过高时，琥珀酸产量有所下降，可能是由于发酵过程中Na+浓度处于较高水平，造成高渗环境。这对菌体有较大的负面作用，使细胞不能正常代谢，最终导致琥珀酸产量的降低。

2.2.4 响应面优化琥珀酸发酵培养基中的主要因素

响应面分析法（response surface methodology，RSM）是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法[10]。利用响应面法优化琥珀酸放线杆菌的发酵培养基也是近几年来研究的热点。周彬等[12]通过响应曲面法（RSM）优化琥珀酸放线杆菌培养基组分，得到最优发酵条件葡萄糖质量浓度、酵母膏质量浓度、温度、培养基初始pH分别为39.1g/L、20.5g/L、37.3℃、7.6，最终，琥珀酸的发酵产量为37.2g/L。杨昆等[13]利用葡萄糖为原料，通过响应面法优化产琥珀酸发酵培养基，最终琥珀酸产量为33.45g/L。

为了提高琥珀酸产量，可采用响应面法优化培养基。考虑到该试验是优化产琥珀酸的发酵培养基，结合了前期试验和文献报道，确定碳源水解糖、氮源玉米浆和培养基中的酸碱中和剂Na2CO3为自变量考察因素，以琥珀酸质量浓度为响应值，以反应过程参数对琥珀酸产量的影响，以及各因素之间的交互作用，确定影响响应值的显著因素。经过单因素初步优化，确定了3个因素的添加量范围。对3个显著因子编码，各因子设定水平及编码见表1。

表1 试验设计因素及编码水平Table 1 Factors and coding levels of the experiment

为进一步考虑3种因素的交互作用及最佳添加量，采用Box-Behnken中心组合试验设计，进行3因素3水平试验。以琥珀酸产量为响应值，试验设计及结果见表2，利用Design Expert软件对表2数据进行多元回归拟合。获得响应值—琥珀酸质量浓度（Y）对影响琥珀酸质量浓度的显著因素—水解糖质量浓度（X1）、玉米浆质量浓度（X2）和Na2CO3添加量（X3）的二次多项式回归模型为Y=19.61+0.62X1+ 0.034X2+0.46X3-0.33X1X2+1.11X1X3+1.51X2X3-1.85X1X1-2.84X2X2-3.45X3X3。

由表3的回归模型方差分析可知，模型（P值＜0.000 1）是非常显著的，模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率[11]。而失拟项P值0.317 4＞0.05，模型失拟项不显著，说明残差由随机误差引起，模型选择合适。回归系数R2=0.983 7＞0.9，拟合度＞90%，说明模型相关度很好，可以使用该模型来分析响应值的变化，试验误差较小，可用此模型对琥珀酸浓度进行分析和预测。

由表4可知，回归模型中的一次项X1（水解糖质量浓度，g/L）的P值0.015 1＜0.05，表示影响非常显著；而X2（玉米浆质量浓度，g/L）的P值0.866 1＞0.05，表示影响不显著；X3（Na2CO3添加量，mL）的P值为0.048 8，影响较显著；交互项中X1X3的P值为0.0049，影响非常显著，X2X3的P值为0.0009，影响也非常显著，而另外一个交互项X1X2的P值为0.273 3，交互作用不显著。该结果表明水解糖质量浓度和pH调节剂Na2CO3的添加量对产琥珀酸放线杆菌发酵产琥珀酸的发酵产量影响较明显，且水解糖质量浓度和pH调节剂Na2CO3的添加量对琥珀酸质量浓度交互作用较明显。根据系数估计值X1=0.62、X2=0.034和X3=0.46，可知影响因素的显著性顺序为：水解糖质量浓度＞Na2CO3添加量＞玉米浆质量浓度。

表2 响应面法试验设计与结果Table 2 Design and result of response surface methodology

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

表4 回归模型系数的显著性检验Table 4 Significance test of regression model coefficient

2.2.5 模型交互项的分析

基于二次回归模型进行响应面及等高线如图7所示。

图7 各因素相互作用对琥珀酸产量的影响的响应面图与等高线图Fig.7 Response surface plot and contour plot of interaction among corn syrup concentration,hydrolyzate concentration and Na2CO3addition on succinate production

由图7可知，玉米浆质量浓度不变，随着水解糖质量浓度的增加，琥珀酸产量也呈递增趋势，当水解糖质量浓度逐渐接近60g/L时，琥珀酸产量呈递增趋势，若水解糖质量浓度持续升高，则琥珀酸产量会逐渐呈下降趋势，可能原因是由于水解糖质量浓度过高或玉米秸秆水解液中的有毒物质过高从而抑制了产琥珀酸放线杆菌的代谢所致。

由图7可知，当水解糖质量浓度不变时，Na2CO3添加量逐渐接近2mL时，琥珀酸产量呈递增趋势；若Na2CO3添加量继续增加，则琥珀酸产量会呈下降趋势。这是由于高浓度的Na2CO3会造成微生物的渗透压升高，从而抑制微生物代谢，影响琥珀酸的发酵产量。

由图7可知，当Na2CO3添加量不变时，若玉米浆质量浓度逐渐接近10g/L时，琥珀酸产量呈递增趋势；若继续增加玉米浆质量浓度，琥珀酸的产量则会呈下降趋势。

基于以上图7的响应面模型分析可知，响应值存在最大值，经软件分析计算，得到琥珀酸产量预测值最大时的组分含量：水解糖质量浓度为60g/L，玉米浆质量浓度为10g/L，Na2CO3（浓度为10mol/L）添加量为2mL，预测值为19.6134g/L。经过拟合试验的验证，琥珀酸产量实际值为18.32g/L。验证值与响应面模型优化值基本一致。并获得了较高的琥珀酸产量，提高了产琥珀酸放线杆菌的发酵产量，说明优化模型可靠性较好。

2.3 1L厌氧瓶分批发酵放大试验

经过发酵条件的优化，采用最优的发酵条件，以水解糖质量浓度为59.66g/L（葡萄糖质量浓度为28.84g/L、木糖质量浓度为30.82g/L）的玉米秸秆水解液为原料在1L厌氧甁中进行分批发酵放大试验，结果如图8所示。

图8 1L厌氧瓶中琥珀酸产量和副产物乙酸变化趋势Fig.8 Variation tendency of succinate and byproducts acetic acid production in anaerobic bottle of 1 L

由图8可知，在产琥珀酸放线杆菌发酵6h后琥珀酸产量开始大量产生，24h琥珀酸生成速率达到最大，42h琥珀酸的产量达到最高值19.66g/L，此时，琥珀酸生成速率为0.47g/（L·h）。此外，在产琥珀酸放线杆菌发酵产琥珀酸过程中还会伴有少量的副产物乙酸的生成。

3 结论

利用玉米秸秆为原料，通过以水解糖质量浓度为39.99g/L（葡萄糖质量浓度为19.07g/L、木糖质量浓度为20.82g/L）的玉米秸秆水解液为基础，对温度培养基和初始pH等因素并结合响应面进行了厌氧甁条件下影响因素的优化研究，得出产琥珀酸放线杆菌（A.succinogenes）ATCC 55618发酵产琥珀酸的最佳培养条件：温度37℃、初始pH 6.8、水解糖质量浓度70g/L、玉米浆质量浓度10g/L、Na2CO3（10mol/L）2mL。并在1L的厌氧甁中进行了分批发酵放大试验，琥珀酸产量最高达19.66g/L。可以为进一步利用纤维水解液为原料来扩大规模发酵琥珀酸提供一定的参考。

本研究的主要优势在于采用可持续利用的秸秆原料，并采用廉价的工业氮源，这将会有效减少现今琥珀酸发酵对淀粉原料的依赖性，并且降低原料成本[6]。这不仅摆脱了对化石能源的依赖，同时又不会与人争粮，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，使琥珀酸成为未来最重要的生物基化工产品之一[14-16]。

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Optimization of succinic acid fermentation from corn stalk hydrolysate

XIE Hui1,ZHANG Zhaokun1,WU Qiong1,WANG Fengqin1,REN Tianbao2,SONG Andong1*
(1.College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

Using corn stalk hydrolysate as raw material,the fermentation conditions ofActinobacillus succinogenesATCC 55618 were optimized.The effect of culture temperature,initial pH,and medium composition on the production of succinic acid was studied,and the addition of hydrolysised sugar,corn syrup and Na2CO3was optimized by response surface methodology.Results showed that the optimal fermentation was determined as follows:temperature 37℃,initial pH 6.8,hydrolysised sugar mass concentration 60 g/L,corn syrup mass concentration 10 g/L,and 10 mol/L Na2CO32 ml.Scale-up experiments were performed in 1 L anaerobic bottle,and the yield of succinic acid could reach 19.66 g/L.

corn stalk;hydrolysate;succinic acid;optimization;response surface methodology

TQ424.19

A

0254-5071（2014）04-0110-06

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.027

2014-02-23

“十二五”863计划生物和医药技术领域国家科技计划课题（2012AA022301）

谢慧（1979-），女，讲师，博士研究生，研究方向为生物基产品的开发与应用。*

宋安东（1972-），男，教授，博士，研究方向为微生物能源工程。