鱼鳞胶原多肽的制备研究

周 亮，程 威，胡文翠，吴正奇，*

（湖北工业大学轻工学部食品与制药工程学院，湖北武汉 430068）

鱼鳞胶原多肽的制备研究

周 亮1，程 威2，胡文翠3，吴正奇1，*

（湖北工业大学轻工学部食品与制药工程学院，湖北武汉 430068）

利用单因素实验优化热水法提取鱼鳞胶原蛋白工艺，使用正交实验优化胶原多肽酶解工艺。最佳提取工艺为：温度70℃，时间6h，料液比1∶20，胶原蛋白的得率为32.55%；酶解最佳工艺为：pH9.5，温度55℃，时间2.0h，酶量0.3%，最大水解度达23.17%；用氨基酸自动分析仪和凝胶渗透色谱法测定胶原多肽氨基酸分布情况和分子质量，结果表明：氨基酸组成符合胶原蛋白特征，胶原多肽分子质量大部分在1000u以内。

鱼鳞，胶原蛋白，酶解，胶原多肽，分子质量

鱼鳞主要由蛋白质和羟基磷灰石组成，脂肪含量极少（＜1%），蛋白质占鱼鳞总质量的50%～70%，其中胶原蛋白（12%～38%）含量丰富，是制备水解胶原多肽的良好原料[1]。胶原多肽源于动物蛋白，其分子结构和植物蛋白相比更适合人体吸收，它不仅具有一般蛋白质的营养作用，还具有不可替代的调节功能和良好的营养特征，人体吸收率达90%以上[2-4]。

传统胶原蛋白的提取多采用酸碱脱钙脱脂处理，周期长，步骤繁琐，对生产设备要求高，成本较高，但得率低[5-7]。本文以草鱼鳞为原材料，采用热水法直接将胶原蛋白从鱼鳞中分离出来，然后以高活性的碱性蛋白酶酶解获取分子质量较小的胶原多肽。鱼鳞胶原蛋白在40℃以上变性降解成明胶溶于热水中[8-9]，能有效地从鱼鳞中分离出来，步骤简单，成本低，得率高，品质好[10]。人体吸收蛋白质主要以多肽的形式，分子量在1000u以下的多肽无需分解可被人体直接吸收；合理利用鱼鳞制备胶原多肽不仅可以推动水产加工业的发展，还能够变废为宝，减少环境污染，也为解决补胶原蛋白问题开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草鱼鱼鳞 收集于湖北工业大学南门菜市场；氢氧化钠、氢氧化钾、酒石酸钾钠、盐酸、硼酸、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；碱性蛋白酶 诺维信（中国）生物技术有限公司。

UV-2000型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；DK-S22型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；SXJQ-1型数显直流无级调速搅拌器 郑州长城科工贸有限公司，RE52CS型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；GZX-9140MBE型数显鼓风干燥箱 上海博讯是有限公司医疗设备厂；AR2140型分析天平 美国奥豪斯公司；TDL-50B型离心机 上海安亭科学仪器厂；DELTA 320型pH计 梅特勒仪器有限公司；QSL-08型消化炉、QSY型自动定氮仪 上海爱朗仪器有限公司；氨基酸自动分析仪 上海仁特检测仪器有限公司；TSKgel2000SWXL型凝胶柱 日本TSK公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼鳞主要成分的测定 原料预处理：将草鱼鳞洗干净，晾干鱼鳞表面的水分，部分用于测定含水率，其他的置于鼓风干燥箱烘干，密封保藏。

水分测定：恒温干燥法（GB/T 5009.3-2010）；灰分测定：高温灼烧法（GB/5009.4-2010）；总氮含量测定：凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2010）；脂肪含量的测定：酸水解法（GB/T 21514-2008）。

1.2.2 胶原蛋白的提取 取相同质量（5g）的干鱼鳞进行单因素实验，将提取的胶原蛋白定容至相同体积，再取一定体积溶液测定吸光度。明胶与双缩脲试剂反应的吸光度（560nm）与蛋白含量成正比，比较吸光度大小确定最佳提取工艺条件。由于影响条件时间、温度和料液比相互间的影响极小，独立性比较强，并且各单因素实验水平梯度较小，单因素实验就能够较确定最佳取值。

1.2.2.1 提取胶原蛋白的工艺优化 影响提胶的主要影响因素有温度、时间和料液比。通过比较明胶（相同体积）与双缩脲试剂反应的吸光度大小，确定最佳熬胶条件。

a.取温度70℃，料液比1∶25，时间的选择：设计3、4、5、6、7、8h 6个水平，确定最佳提取时间。

b.取时间6h，料液比1∶25，提取温度的选择：设计50、60、70、80、90℃ 5个水平，确定最佳提取温度。

c.取温度70℃，时间6h，料液比的选择：设计1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 5个水平，确定最佳提取料液比。

1.2.3 胶原蛋白的酶解工艺优化

1.2.3.1 酶解水解度测定 影响胶原蛋白酶解的因素有底物浓度、温度、时间、pH、酶添加量，实验以蛋白质的水解度为指标，通过单因素实验和正交实验确定最佳酶解工艺，采用pH-state法[11]测定水解度。取固定浓度为3.2%胶原蛋白液50mL，添加标准氢氧化钠溶液（0.5mol/L），用于保持水解液中的pH稳定，记录下消耗碱液的体积，代入公式即可求得水解度。

水解度的公式为：

式中：DH—水解度；Nb—NaOH的摩尔浓度（mol/L）；B—消耗碱量（mL）；MP—底物蛋白的质量（g）；htot—每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数，胶原蛋白取8.41；α—α-氨基的平均解离度。

平均解离度公式为：

式中，pH—水解液的酸碱度；pK—-NH3解离常数。

1.2.3.2 水解度单因素实验 a.取时间2.0h，pH9.5，酶添加量0.3%，设计40、45、50、55、60、65、70℃7个水平，确定酶解温度对水解度影响的变化趋势。

b.取温度55℃，pH9.5，酶添加量0.3%，设计0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h 5个水平，确定酶解温度对水解度影响的变化趋势。

c.取时间2.0h，温度55℃，酶添加量0.3%，设计pH8.5、9.0、9.5、10、10.5 5个水平，确定酶解pH对水解度影响的变化趋势。

d.取 时 间 2.0h，温 度 55℃ ，pH9.5，设 计 0.1% 、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%5个水平，确定酶添加量对水解度影响的变化趋势。

1.2.3.3 正交实验 取酶解温度、时间、pH、酶（质量浓度20%碱性蛋白酶溶液）添加量为主要参考因素，以水解度为指标，采用正交表L9（34）进行4因素、3水平正交实验，实验因素水平见表1。

表1 L9（34）正交实验因素水平Table 1 L9（34）Factors and levels of orthogonal design

1.2.4 胶原多肽分子质量分布及氨基酸组成测定 以最佳工艺条件制备鱼鳞胶原多肽，分别采用氨基酸自动分析仪（湖北省农科院农检所）和凝胶渗透色谱法（湖北工业大学魔技术研究所）测定氨基酸组成及分子质量分布。

采用阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解氨基酸的组分含量进行分析，测定在pH5～5.5、100℃下进行，反应时间为10～15min，利用比色法将生成的紫色物质在570nm波长下测定。

色谱柱：TSK gel G2000SWXL（7.8mm×cm，Tosoh）；流动相：乙腈/水/三氯乙酸（10∶90∶0.1，V/V/V）；柱温；39℃ ；检 测 波 长 ：220nm；流 速 ：0.8mL/min；进 样 量 ：20μL。

1.2.5 数据处理 检测结果经检测方处理后再整理。做一个氨基酸全分析一般只需1h左右，同时可将几十个样品一起装入仪器，自动按序分析，最后自动计算给出精确的数据，取三组平行实验结果的平均值。胶原多肽的分子质量具有多分散性，其分子质量具有统计平均的意义，根据测定结果计算不同区域分子质量的胶原多肽平均百分含量。

2 结果与分析

2.1 草鱼鳞基本化学组成

新鲜草鱼鳞的含水量约为20.25%。干草鱼鳞的主要成分见表2，可知草鱼鳞中含有丰富的粗蛋白，粗蛋白含量占干物质约66.06%，灰分约占干物质约31.79%，而脂肪含量＜1%，其他杂质含量极小。灰分在中性环境中难容，加热条件下，角蛋白不溶于水，而胶原蛋白会降解成明胶而溶于热水中，其他杂蛋白因加热变性沉淀出，通过热水法制备胶原蛋白简单、方便、节约成本，还可以提高蛋白的纯度。

表2 草鱼鳞的基本化学组成Table 2 Basic chemical composition of grass fish scales

2.2 胶原蛋白的提取

热水法提取胶原蛋白的影响因素主要有料液比、pH、温度和时间，由于此法以软水为介质，不添加酸和碱，故pH对实验的影响不考虑。热水法提取胶原蛋白在节约时间及成本的情况下，得率也较高，测定吸光度曲线可以定性地反映蛋白浓度变化趋势，可快速、有效地比较各单因素实验的提取效果。

2.2.1 时间对提胶的影响 由图1可知，温度和料液比一定时，随着提取时间的延长，可溶性胶原蛋白量越来越多，当时间超过6h继续延长熬胶时间，胶原蛋白质量的增加并不明显，可能鱼鳞中绝大部分胶原蛋白已经溶出，少量与羟基磷灰石结合紧密的胶原蛋白难以溶出，随时间的延长，溶液的水分蒸发，溶液中胶原蛋白达到平衡状态，鱼鳞中胶原蛋白不再继续溶出。

图1 时间对胶原蛋白提取率的影响Fig.1 The effect of time on the extraction rate of collagen

2.2.2 温度对提胶的影响 由图2可知，时间和料液比一定时，随着温度的升高，可溶性胶原蛋白越来越多，温度到70℃左右时，胶原最多，随着温度继续升高，胶原蛋白质量逐渐降低，一方面可能高温条件下，溶液中的水分蒸发较快，导致溶液中胶原蛋白浓度增大，促使了溶质快速达到平衡状态，从而影响了胶原蛋白浓度溶出，另一方面长时间高温条件，导致一部分蛋白质降解成分子质量小的物质随水蒸气挥发掉。

2.2.3 料液比对提胶的影响 由图3可知，温度和时间一定时，可溶性胶原蛋白随料液比增大而先增后降，料液比为1∶20时，胶原蛋白的溶出量达到最大。料液比太小，水添加量少，干鱼鳞难以溶胀，胶原蛋白不易摆脱羟基磷灰石的束缚，并且溶液中胶原蛋白浓度容易很快达到饱和状态，加上搅拌不均匀，不利于胶原蛋白的溶出。

图2 温度对胶原蛋白提取率的影响Fig.2 The effect of temperature on the extraction rate of collagen

图3 料液比对提取率的影响Fig.3 The effect of material to liquid ratio on the extraction rate of collagen

取3份一定量的干燥鱼鳞在最佳提取条件时间6h、温度70℃和料液比1∶20的条件下制备蛋白，其平均提取率可达到32.55%，在鱼鳞含12%～38%胶原蛋白的范围内。

2.3 胶原蛋白的水解

2.3.1 单因素实验 在胶原蛋白浓度固定的情况下，影响胶原蛋白酶解的主要因素为温度、时间、pH、酶添加量。

2.3.1.1 时间对水解度的影响 由图4可知，温度、pH和酶添加量不变时，胶原蛋白水解度随着时间的增加而升高，当时间超过1.5h后，水解度保持平缓，可能随着酶解的进行，底物浓度降低，并且长时间的酶解使蛋白酶的酶活性下降，导致酶解速率下降，也可判断胶原蛋白基本酶解完全，延长酶解时间，不仅消耗更大，还会使胶原蛋白酶解成分子质量更小的氨基酸，影响胶原多肽的品质。

图4 时间对水解度的影响Fig.4 The effect of time on the extraction rate of collagen

2.3.1.2 温度对水解度的影响 由图5可知，时间、pH和酶添加量不变时，胶原蛋白的水解度在50～55℃较高，可知在此温度范围内，碱性蛋白酶的活性最大，胶原蛋白的酶解速率最快，而温度低，酶的活性受抑制，温度太高，酶易失活，均会降低酶解速率。

图5 温度对水解度的影响Fig.5 The effect of temperature on the extraction rate of collagen

2.3.1.3 pH对水解度的影响 由图6可知，温度、时间和酶添加量不变时，胶原蛋白的水解度在pH9.5左右最大，说明在此pH条件下，碱性蛋白酶的活性最大，酶解效果最好，而pH太低或太高，酶的活性受抑制，均会降低酶解速率。

图6 pH对水解度的影响Fig.6 The effect of pH on the extraction rate of collagen

2.3.1.4 酶量对水解度的影响 由图7可知，在温度、时间和pH不变时，胶原蛋白的水解度随着酶添加量增大先升高后平稳，说明酶添加量在0.2%～0.3%范围内已经达到饱和，再增加酶量也不能提高胶原蛋白的水解度，即在酶量达到饱和状态下对酶解最适宜。2.3.2 正交实验 由正交实验数据处理结果（表3）可知，影响胶原蛋白水解的因素主次顺序为：A＞D＞ B＞C，即时间和酶添加量对胶原蛋白酶解的影响比较大，而温度和pH影响相对较小，最佳酶解条件组合为：A3B3C2D3，即时间2.0h，温度55℃，pH9.5，酶添加量0.3%，验证实验表明此条件下的最大水解度达23.17%，比正交实验中的最优组合所得结果（21.21%）大。

图7 酶添加量对水解度的影响Fig.7 The effect of temperature on the extraction rate of collagen

表3 正交实验结果Table 3 The test data of orthogonal of four factors in three-level list

表4 正交实验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal results

由于因素C（pH）的极差为0.6，很小，故可将它的方差分析忽略不计，故可做如表4的正交实验结果方差分析。由方差分析结果看出，在本实验中A、D因素的水平变化对实验结果影响非常显著（p＜0.05），其中A比D显著，而B、C因素的水平变化对实验影响不显著（p＞0.05），即时间和酶添加量对酶解的影响显著，而温度和pH影响不显著，与正交实验结果分析一致。

2.4 胶原多肽氨基酸组分及平均分子质量

2.4.1 氨基酸的分布情况 通过氨基酸自动分析仪进行检测，由表5可知，胶原多肽中甘氨酸含量为22.5496%，羟脯氨酸含量为10.1265%，脯氨酸含量氨基酸含量12.9158%，色氨酸未检测出，氨基酸组成符合胶原蛋白的特征。

表5 胶原多肽氨基酸的分布Table 5 The composition of the amino acids

2.4.2 分子质量的分布情况 鱼鳞水解胶原多肽分子质量分布见表6，碱性蛋白酶水解的鱼鳞胶原蛋白的分子质量在1638～451.5u的多肽占11.66%，分子质量451.5u的多肽占69.76%，分子质量451.5～189.7u的多肽占18.42%，即大部分水解胶原多肽的分子质量在1000u以内，适合人体的吸收。

表6 分子质量分布Table 6 Distribution of molecular mass of collagen peptide

3 结论

热水法提取胶原蛋白是提取鱼鳞胶原蛋白的绿色方法，在时间6h、温度70℃和料液比1∶20的最佳提取工艺条件下，鱼鳞胶原蛋白的得率达到32.55%，能够提取出鱼鳞中大部分胶原蛋白，并且实验中双缩脲法快速简单，定性准确，有效减少了实验量。但是实验中由于草鱼鳞韧性较大，不易粉碎，一定程度上增加了提取时间和降低了提取率。

在时间2.0h、温度55℃、pH9.5、酶添加量0.3%的最佳酶解条件下，胶原多肽的水解度达到23.17%，制备的胶原多肽的氨基酸分布符合理论要求，并且胶原多肽的分子质量较小，适合人体的吸收利用。

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Study on extracting collagen polypeptide from fish scale

ZHOU Liang1，CHENG Wei2，HU Wen-cui3，WU Zheng-qi1，*
（Food and Pharmaceutical Engineering Institute，Light Industry Department，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Using single factor experiments to optimize technology that hot water was used to extract collagen from fish scale.Then，using orthogonal experiments to optimize the enzymolysis technology of collagen peptide that were studied.When extraction temperature of solution was 70℃ ，extraction time was 6 hours and ratio of material to solvent was 1 ∶20，the optimum extraction process was obtained，and the maximum yield was 32.55%.When the pH of solution was 9.5，the temperature of solution was 55℃，the reaction time was 2.0 hours and amount of enzyme was 0.3% （v/v） ，the optimum extraction process of collagen enzyme was obtained，and the largest degree of hydrolysis was 23.17%.Automatic amino acid analyzer was used to measure amino acids of collagen polypeptide distribution，its amino acid composition was according with the characteristic of collagen.Gel permeation chromatography was used to determine the molecular mass of collagen peptide ，most of the molecular mass of collagen peptide was within 1000u.

fish scale；collagen；enzymatic hydrolysis；collagen polypeptide；molecular mass

TS254.9

B

1002-0306（2014）20-0327-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.063

2014-01-16

周亮（1987-），男，硕士研究生，研究方向：农产品加工。

* 通讯作者：吴正奇（1966-），男，教授，研究方向：蛋白质资源利用和食品加工新技术与新工艺。