响应面法优化产虾青素假单胞菌的发酵培养基

刘 艳，冯 印，莫 言，闵伟红，马景喜，*

（1.长春科技学院，生物食品学院，吉林长春 130600；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，发酵工程实验室，吉林长春 130118）

响应面法优化产虾青素假单胞菌的发酵培养基

刘 艳1，冯 印1，莫 言1，闵伟红2，马景喜1，*

（1.长春科技学院，生物食品学院，吉林长春 130600；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，发酵工程实验室，吉林长春 130118）

利用响应面法对产虾青素菌株的培养基进行优化，确定发酵培养基最佳配方。最佳的培养基配方为KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.08%，酵母膏0.3%，可溶性淀粉1.2%，在此发酵条件下虾青素产量最高，为149.4mg/L。同时建立虾青素产量与KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、可溶性淀粉的添加量之间的二次多项式模型，该模型可以很好地预测虾青素产量，可获得最佳的工艺条件。

虾青素，假单胞菌，培养基优化，响应面

本实验室在前期研究中，从土壤中筛选出产虾青素的假单胞菌株并对其进行诱变得到了一株高产虾青素的假单胞菌株（CTD004），其虾青素的细胞产率可达到119mg/L。显示该菌株具有很强的虾青素生产能力。因此，为了进一步提高CTD004菌株的虾青素生产能力和产业化利用价值，本研究利用响应面法对产虾青素假单胞菌的发酵培养基进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

CTD004菌株（自命名，经初步鉴定属于沼泽红假单胞菌） 吉林农业大学发酵工程实验室；虾青素标准样品 购于Sigma公司；二甲基亚砜、氯仿、甲醇、冰醋酸、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O 均为进口分装或国产分析纯。

AUY220型分析天平SHIMADZU PHILIPPINES；Z36HK型高速冷冻离心机 德国HERMLE公司；SHP-250型生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司；CL-32L型高压蒸汽灭菌器 日本ALP公司；HZQ-C型空气恒温振荡器 哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.2 培养基

斜面培养基：蛋白胨10g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 1g，酵 母 膏2g，琼 脂20g，定 容 至1L蒸 馏水中，pH7.2～7.5，121℃，灭菌20min。

种子培养基：蛋白胨10g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 1g ，酵 母 膏 2g，定 容 至 1L 蒸 馏 水 中 ，pH7.2～7.5，121℃，灭菌20min。

式中:Yk是随机高度;X和Z分别是射程和方向散布;k是随机高度编号1～10;rk是-0.05至0.05之间符合均匀分布的10个随机数(由蒙特卡洛法生成)；n为随机数的个数。

发酵培养基：蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 1g，酵 母 膏2g，定 容 至 1L 蒸 馏 水 中 ，pH7.2～7.5，121℃，灭菌20min。

1.3 实验方法

1.3.1 培 养 方 法 将 斜 面 保 存 的 菌 种 接 入 装 有30mL/250mL种子培养基的摇瓶中，160r/min、30℃培养12h进行活化。将活化的菌液装入50mL/500mL发酵培养基的摇瓶中，160r/min、30℃培养72h，取发酵液测定虾青素的含量。

1.3.2 发酵培养基的单因素优化

1.3.2.1 可溶性淀粉和酵母膏添加量的确定 选择可溶性淀粉添加量为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，其他同发酵培养基，单因素实验选择最佳的可溶性淀粉添加量；选择酵母膏添加量为0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%其他同发酵培养基，单因素实验选择最佳的酵母膏添加量。

1.3.2.2 MgSO4·7H2O和KH2PO4添加量的确定 选择MgSO4·7H2O 添 加 量 为 0.05% 、0.1% 、0.15% 、0.2% 、2%、0.25%其他同发酵培养基，单因素实验选择最佳的MgSO4·7H2O添加量；选择KH2PO4添加量为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、2%、0.25%，其他同发酵培养基，单因素实验选择最佳的KH2PO4添加量。

1.3.3 虾青素含量测定 采用分光光度法测定发酵液中虾青素含量[9]，由于虾青素是一种细胞内色素，需要混合破壁提取试剂提取。甲醇与氯仿按体积比5∶1配成试剂Ⅰ，冰醋酸与二甲基亚砜按体积比5∶1配成试剂Ⅱ，将试剂Ⅰ与试剂Ⅱ按体积比3∶1配成混合破壁试剂。发酵液经8000r/min离心10min后，用蒸馏水洗两遍，离心得鲜菌体，搅拌后加入混合破壁试剂，环境温度为30℃。搅拌，于8000r/min离心10min得提取液，480nm下，以混合破壁试剂作为参比液调零，测定其OD值。将OD值代入虾青素的标准曲线y= 1.2786x-0.0088（R2=0.9995），即可算出发酵液中虾青素的含量。

1.3.4 响应面优化 在单因素实验结果基础上，采用 Box-Behnken 响 应 面 实 验 设 计 法[10-15]，以 KH2PO4、MgSO4·7H2O，酵母膏，可溶性淀粉为自变量，分别以X1、X2、X3、X4表示，以虾青素产量为指标进行优化见表1。

表1 Box-Behnken响应面设计实验因素及编码Table 1 Factors and their coded levels in response surface design

1.4 数据统计与分析

采 用Design-Expert软 件（Version 7.0 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA）对响应面实验得到的数据进行线性回归和方差分析[16-17]，模型及因素的显著性均通过F值考察（p＜0.05），所有实验均做3个重复。

2 结果与分析

2.1 培养基的单因素优化

2.1.1 可溶性淀粉添加量对虾青素产量的影响 由图1可看出，当可溶性淀粉添加量为0.5%～1%时，虾青素的含量不断增加，并达到最大值101.5mg/L，继续增加可溶性淀粉添加量，虾青素的含量逐渐降低。因此，确定可溶性淀粉最佳添加量为1%。

图1 可溶性淀粉对菌种产虾青素的影响Fig.1 Effect of soluble starch addition amount on astaxanthin production by the strain

2.1.2 酵母膏对菌株产虾青素的影响 由图2可看出，当酵母膏添加量为0.25%～1%时，虾青素的含量不断增加，并达到最大值109.5mg/L，继续增加酵母膏的添加量，虾青素的含量逐渐降低。因此，确定酵母膏最佳添加量为1%。

2.1.3 MgSO4·7H2O 的 添 加 量 对 菌 株 产 虾 青 素 的 影响 由 图3可 看 出 ，当MgSO4·7H2O添 加 量 为0.05% ～0.1%时，虾青素的含量不断增加，并达到最大值111.7mg/L，继 续 增 加 MgSO4·7H2O 添 加 量 ，虾 青 素 的含量逐渐降低。因此，确定MgSO4·7H2O最佳添加量为0.1%。

图2 酵母膏对菌种产虾青素的影响Fig.2 Effect yeast powder addition amount on astaxanthin production by the strain

图3 MgSO4·7H2O的添加量对菌种产虾青素的影响Fig.3 Effect of MgSO4·7H2O addition amount onastaxanthin production by the strain

2.1.4 KH2PO4的添加量对菌株产虾青素的影响 由图4可看出，当KH2PO4添加量为0.2%～0.3%时，虾青素的含量不断增加，并达到最大值118.7mg/L，继续增加KH2PO4添加量，虾青素的含量逐渐降低。因此，确定KH2PO4最佳添加量为0.3%。

图4 KH2PO4的添加量对菌种产虾青素的影响Fig.4 Effect of KH2PO4addition amount on astaxanthin production by the strain

2.2 响应面设计结果与分析

根据单因素结果，采用Design-Expert软件分别对KH2PO4、MgSO4·7H2O，酵母膏，可溶性淀粉进行优化，实验结果如表2所示。

用Design-Expert软件，对表2进行多元回归拟合，可以得到响应值影响显著的回归方程为：12.85X12-8.07X22-14.69X32-20.89X42，对回归方程求一阶偏导数，解得X1=0.32，X2=-0.4，X3=-0.36，X4=0.42即可换算得到：KH2PO40.4%，MgSO·47H2O 0.08%，酵母膏0.3%，可溶性淀粉1.2%，虾青素理论产率达到155.3mg/L。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Response surface design and corresponding results

对回归方程进行显著性检查、方差分析，结果如表3所示。

由表3可知，回归模型系数显著性检验结果：模型的一次项X4极显著，X2显著，其余不显著，二次项X12、X32、X42极显著，交互项都不显著。表明各个影响因素与响应值不是简单的线性关系。

方差的F值为8.25，Pr＞F值为0.004＜0.001，说明用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，因变量和全体自变量之间的线性关系极显著，即这种方法是可靠的。复相关系数R2=0.9059说明拟合度良好，实验误差小，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。经三次重复实验结果可知虾青素产率为149.4mg/L，接近预测值155.3mg/L，说明响应面法适用于对虾青素菌种发酵工艺条件进行回归分析和参数优化。根据中心复合设计结果做出三维响应面（图5～图8）。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model equation

图5为MgSO4·7H2O和酵母膏对虾青素产量的响应曲面图和其投影的等高线图，等高线图形状近乎圆形，表明MgSO4·7H2O和酵母膏两个自变量之间交互效应较弱。图6为可溶性淀粉和酵母膏对虾青素产量的响应曲面图和其投影的等高线图，等高线图形状近乎圆形，表明可溶性淀粉和酵母膏两个自变量之间交互效应较弱。图7为KH2PO4和可溶性淀粉对虾青素产量的响应曲面图和其投影的等高线图，等高线图形状近乎圆形，表明MgSO4·7H2O和酵母膏两个自变量之间交互效应较弱。图8为MgSO4·7H2O和酵母膏对虾青素产量的响应曲面图和其投影的等高线图 ，等 高 线 图 形 状 近 乎 圆 形 ，表 明 MgSO4·7H2O 和 可溶性淀粉两个自变量之间交互效应较弱。因此表明各个影响因素与响应值不是简单的线性关系。

图5 MgSO4·7H2O和酵母膏对虾青素产量量的影响Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O and yeast powder addition amount on astaxanthin produced by the strain

图6 酵母膏和可溶性淀粉对虾青素产量的影响Fig.6 Effect of starch and yeast powder addition amount on astaxanthin produced by the strain

图7 KH2PO4和可溶性淀粉对虾青素产量量的影响Fig.7 Effect of KH2PO4and starch addition amount on astaxanthin produced by the strain

图8 MgSO4·7H2O和可溶性淀粉对虾青素产量的影响Fig.8 Effect of starch and MgSO4·7H2O addition amount on astaxanthin produced by the strain

3 结论

利用实验设计软件Design-Expert，通过二次回归设计得到了提高虾青素产量的CTD004菌株与KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.08%，酵 母 膏0.3%，可 溶 性 淀 粉1.2%的回归模型，经检验证明该模型是合理可靠的，能够较好地预测虾青素得率。在对影响虾青素得率的关键因素及其相互作用进行探讨后，得到的优化工艺参数为：KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.08%，酵母膏0.3%，可溶性淀粉1.2%时，虾青素的理论值为155.3mg/L，验证实验结果为149.4mg/L。因此，利用响应面分析方法对虾青素菌种发酵工艺进行优化，可获得最优的工艺参数，从而为进一步的实验研究奠定基础。

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Response surface optimization of fermentation medium for astaxanthin by pseudomonas

LIU Yan1，FENG Yin1，MO Yan1，MIN Wei-hong2，MA Jing-xi1，*
（1.College of Biological and Food，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130600，China；2.Fermentation Engineering Laboratory，College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Response surface methodology was used to optimize fermentation medium for astaxanthin production by the strain.The highest astaxanthin yield of 149.4mg/L was achieved under the following conditions：KH2PO40.4% ，MgSO4·7H2O 0.08% ，yeast powder 0.3%and soluble starch 1.2%.In addition，the established regression model was found to had good effectiveness in predicting astaxanthin yield.

astaxanthin；pseudomonas；fermentation medium；response surface

TS202.3

A

1002-0306（2014）20-0186-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.032

2014－03－12

刘艳（1981-），女，硕士研究生，讲师，研究方向：微生物发酵。

* 通讯作者：马景喜（1981-）男，硕士研究生，讲师，研究方向：功能性食品。

吉林省教育厅项目（2010-515）。