应用微生物法试剂盒检测奶粉中维生素B6的含量

郑悦康　叶志英　刘绮明

[摘要] 目的 建立应用微生物法试剂盒检测奶粉中维生素B6含量的分析方法。 方法 采用维生素B6微生物检测试剂盒定量检测奶粉中添加维生素B6的含量。 结果 维生素B6的线性范围为0.002～0.012 mg/100 g（ml），检出限为0.002 mg/100 g（ml），其标准曲线的相关系数为0.9987，相对标准偏差均<10%，其回收率达到90.0%～108%。 结论 微生物法试剂盒具有灵敏度高，检出限低，线性范围宽，操作方法简便、快捷，结果准确可靠等优点，可用于奶粉中维生素B6的检测工作。

[关键词] 维生素B6；吡哆醇；微生物法

[中图分类号] R155.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0012-03

维生素B6是所有呈现吡哆醛生物活性的3-羟基-2-甲基吡啶衍生物的总称，主要是吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇，在自然界广泛分布，其磷酸化形式是氨基酸代谢过程的辅酶，如转氨酶的辅酶。加入食品中的维生素B6通常为盐酸吡哆醇或5-磷酸吡哆醇形式，5-磷酸吡哆醇也以维生素B6衍生物的形式天然存在于食品中。主要临床应用有：维生素B6缺乏症、婴儿惊厥、血红蛋白缺陷所致的贫血、放射病及某些抗癌药物引起的恶心、呕吐或妊娠呕吐的治疗[1]。据报道每天补充40 mg维生素B6可以防止动脉粥样硬化的发展。研究表明，当维生素B6达到一定血药浓度时，还可以与血小板表面蛋白质、纤维蛋白原及凝血酶原等凝血物质结合，从而阻止血小板聚集，防止血液凝固，延长凝血时间，使血栓不易形成，因而具有预防脑血栓的药理作用[2]。目前，市场上出售的奶粉成分中一般都含有维生素B6，特别在婴幼儿配方奶粉中是必需添加的一种维生素。测定食品中维生素B6的方法有化学法和生物法，化学法主要是仪器分析如液相色谱法[3-4]、气相色谱法[5]、荧光光度法[6-7]、紫外分光光度法[8-9]等。生物法也叫微生物法，其优势则在于：①它是以应用微生物试验对象为基础，测的是生物活性含量，更具生物学意义；②微生物作为一种活试剂，具有自身的特异性和高度的灵敏性，使测定结果较化学方法更为准确。基于这些原因，GB/T5009.154-2003将微生物法规定为测定食品中维生素B6的国家标准方法[10-11]。

本次研究所用的试剂盒利用微生物法的原理，将维生素B6检测培养基和稀释后的样品提取液加入包被有酿酒酵母的微孔中。酿酒酵母的生长离不开维生素B6，加入维生素B6标准品或含维生素B6的样品后，酿酒酵母开始生长直至维生素被完全消耗。30℃避光44～48 h完全孵育。酿酒酵母的代谢或生长强度与提取液中维生素B6的含量有关，可通过在610～630 nm或540～550 nm下采用酶标仪读取溶液混浊度获得，将样品浊度与标准曲线对比即可得到样品中维生素B6含量。

1 材料与方法

1.1 仪器

Sunrise酶标仪（奥地利TECAN）、电子分析天平（上海梅特勒）、离心机（上海安亭）、恒温培养箱（德国BINDER）。

1.2 试剂

VitaFast维生素B6（吡哆醇）检测试剂盒（北京博欧实德生物技术有限公司提供）；盐酸吡哆醇（维生素B6）纯度标准物质（纯度99.7%，中国计量科学研究院生产）；酸性马铃薯磷酸酶（美国Sigma生产）；枸橼酸盐缓冲液（pH4.5）：将1.5 g枸橼酸一水化合物加入100 ml烧杯中，加入50 ml无菌水，边搅拌边溶解，然后加入12 ml NaOH（1 mol/L），用0.1 mol/L HCl将pH调至4.5，将溶液定量转移至100 ml容量瓶中，用无菌水定容；实验用水均为灭菌超纯水；样品均为市售奶粉。

1.3 标准样品的制备

1.3.1 标准储备液 准确称取盐酸吡哆醇（维生素B6）纯度标准物质0.050 g，用枸橼酸盐缓冲液溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，配成50 mg/100 ml溶液，置于冰箱中保存以备用。

1.3.2 标准工作液 在测定时，将标准储备液按比例用枸橼酸盐缓冲液准确稀释成浓度为10 mg/100 ml、25 mg/100 ml。

1.4 样品处理

准确称取1 g均质后的样品，将其加入50 ml无菌离心管中，加入20 ml枸橼酸盐缓冲液，振荡混匀，加入10 mg酸性马铃薯磷酸酶，振荡混匀，37℃避光孵育1 h，同时间歇性振荡，用无菌水补至40 ml。振荡混匀后，在95℃水浴中提取30 min，期间应至少混合5次，然后快速冷却至30℃以下，在>8000 g下离心5 min。根据维生素B6的浓度范围，在1.5 ml无菌离心管中应用无菌水对上清液进一步稀释成100倍或以上，使测定OD值在标准曲线范围内。

1.5 检测步骤

取出所需数量的微孔板条并在板上固定，依次将150 μl维生素B6检测培养基、150 μl标准品或样品稀释液加入微孔中，用黏合箔盖住微孔条或微孔。在30℃培养箱中避光孵育44～48 h。再次向下挤压黏合箔，将微孔板向上放置在桌面上，在桌面平面上振荡，使微生物溶解在培养基中。小心揭开黏合箔，用移液枪头破坏微孔液体表面所有的泡沫。用酶标仪在620 nm条件下测量浑浊度。

1.6 结果计算

应用4参数法进行结果计算。4参数法是指用含有4个参数的方程表示因变量（Y）随自变量（X）变化的规律。目前最常用于免疫检测领域，用于描述吸光度随抗原浓度变化的规律，四参数模式为Y=D+（A-D）/[1+（X/C）^B]。

2 结果

2.1 标准曲线的绘制

分别移取维生素B6的标准品浓缩液（试剂盒自带）按比例稀释成标准系列浓度分别为0.002、0.004、0.006、0.008、0.012 mg/100 g。以标准系列中的维生素B6浓度为横坐标，酶标仪的测量OD值为纵坐标绘制维生素B6的标准曲线（图1）。4参数曲线法线性回归方程为Y=-0.012 763 0+（1.530 362 86+0.012 276 30）/[1+（X/0.006 597 79）^（-1.455 190 92）]，其相关系数为0.9987。

图1 维生素B6的标准曲线

2.2 方法的精密度分析

将进行样品处理的4种不同的奶粉样品分别进行6次维生素B6测定，得出不同样品的相对标准偏差（RSD）值（表1）。

表1 精密度分析（n=6）

2.3 方法的加标回收率

将两种不同的奶粉样品，分别加入质量浓度为10、25、50 mg/100 ml的维生素B6标准溶液各10 μl，再按样品处理的步骤进行处理，然后平行测定6次，得到不同样品的加标回收率（表2）。

表2 加标回收试验（n=6）

3 讨论

由于维生素B6是水溶性维生素，在高温、光线直射、空气暴露等环境条件下，会部分降解损失，故在样品提取操作过程中，要尽可能在避光条件下操作，标准溶液应在冷藏、避光条件下保存并尽快分析。含样品的微孔板在30℃培养箱中避光孵育后，将其放于2～8℃冰箱保存，分别于24、48、72 h取微孔板用酶标仪在620 nm条件下测量浑浊度，结果显示48 h内微孔板中的维生素B6性质稳定。

加入微孔中的样品提取液，样品稀释液用水，以及实验中需要的其他耗材都必须无菌。样品无菌提取后，也必须在无菌环境中进行操作。要保证黏合膜和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分，防止样品液在振荡过程中相互混合影响测量结果。检测样品前要估算样品中维生素B6的含量进行稀释，稀释过程要准确，样品的测量OD值在标准曲线中部的结果可信度较高。

微生物法测定维生素B6的含量近50年来虽然已被广泛地纳入各类国际标准方法中，但在我国应用却很少。微生物法操作繁琐、实验周期长，与目前分析方法简便、快速、高效的发展方向所不符[12]。因此，微生物检测试剂盒通过优化样品处理、试剂配制、反应条件，省略了菌种保存及种子培养液的制备[13]，能有效地简化实验步骤，排除实验过程中的各种干扰，从而达到节省实验时间、减轻工作量，进而得到准确的定量结果的目的，同时该方法检出限、线性关系、精密度、加标回收率、稳定性等技术参数能满足奶粉中维生素B6的微量分析的要求，表明该方法可用于测定奶粉中维生素B6的含量，结果令人满意。

[参考文献]

[1] 陈汝杰.维生素B6临床应用新进展[J].中国临床医生，2010，38（11）：26-27.

[2] 陈伟，王颖.维生素B6的新途径[J].人民军医，1994，13（9）：69-70.

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[4] 宋萍萍，曹江平，刘书慧.反相高效液相色谱法测定果醋中的8种维生素[J].食品科学，2012，33（12）：181-184.

[5] 陈凤恩，赵文超，汪帆.维生素B6中间体的气相色谱分析[J].中国医药工业杂志，2002，33（5）：241-242.

[6] 谢秀娟，张振新.离子液体双水相萃取荧光法测定维生素B6[J].分析科学学报，2011，27（4）：513-515.

[7] 徐烨，顾鑫荣，张秀娟，等.同步荧光法测定功能饮料中维生素B2和B6的研究[J].分析试验室，2008，27（7）：85-97.

[8] 曹高娃，崔毅，张力.紫外分光光度法测定维生素B6 [J].光谱实验室，2001，18（6）：802-803.

[9] 陈恕华.紫外分光光度法测定维生素B6[J].理化检验：化学分册，2005（7）：519，521.

[10] GB/T5009.154-2003.食品中维生素B6的测定[S].

[11] 王为黎，马景宏，张旭，张志宏.运用微生物法测定保健食品中的维生素B6[J].中国微生态学杂志，2006，18（4）：291-295.

[12] 张旭，李援，胡英.微生物分析方法测定保健食品中维生素B6的含量[J].中国微生态学杂志，2005，17（6）：477-478.

[13] 陈亚波，周敏，杨彤.微生物法测定维生素饮料中的维生素B6[J].安徽农业科学，2013，41（12）：5502-5503，5509.

（收稿日期：2013-12-02 本文编辑：郭静娟）

图1 维生素B6的标准曲线

2.2 方法的精密度分析

将进行样品处理的4种不同的奶粉样品分别进行6次维生素B6测定，得出不同样品的相对标准偏差（RSD）值（表1）。

表1 精密度分析（n=6）

2.3 方法的加标回收率

将两种不同的奶粉样品，分别加入质量浓度为10、25、50 mg/100 ml的维生素B6标准溶液各10 μl，再按样品处理的步骤进行处理，然后平行测定6次，得到不同样品的加标回收率（表2）。

表2 加标回收试验（n=6）

3 讨论

由于维生素B6是水溶性维生素，在高温、光线直射、空气暴露等环境条件下，会部分降解损失，故在样品提取操作过程中，要尽可能在避光条件下操作，标准溶液应在冷藏、避光条件下保存并尽快分析。含样品的微孔板在30℃培养箱中避光孵育后，将其放于2～8℃冰箱保存，分别于24、48、72 h取微孔板用酶标仪在620 nm条件下测量浑浊度，结果显示48 h内微孔板中的维生素B6性质稳定。

加入微孔中的样品提取液，样品稀释液用水，以及实验中需要的其他耗材都必须无菌。样品无菌提取后，也必须在无菌环境中进行操作。要保证黏合膜和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分，防止样品液在振荡过程中相互混合影响测量结果。检测样品前要估算样品中维生素B6的含量进行稀释，稀释过程要准确，样品的测量OD值在标准曲线中部的结果可信度较高。

微生物法测定维生素B6的含量近50年来虽然已被广泛地纳入各类国际标准方法中，但在我国应用却很少。微生物法操作繁琐、实验周期长，与目前分析方法简便、快速、高效的发展方向所不符[12]。因此，微生物检测试剂盒通过优化样品处理、试剂配制、反应条件，省略了菌种保存及种子培养液的制备[13]，能有效地简化实验步骤，排除实验过程中的各种干扰，从而达到节省实验时间、减轻工作量，进而得到准确的定量结果的目的，同时该方法检出限、线性关系、精密度、加标回收率、稳定性等技术参数能满足奶粉中维生素B6的微量分析的要求，表明该方法可用于测定奶粉中维生素B6的含量，结果令人满意。

[参考文献]

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[7] 徐烨，顾鑫荣，张秀娟，等.同步荧光法测定功能饮料中维生素B2和B6的研究[J].分析试验室，2008，27（7）：85-97.

[8] 曹高娃，崔毅，张力.紫外分光光度法测定维生素B6 [J].光谱实验室，2001，18（6）：802-803.

[9] 陈恕华.紫外分光光度法测定维生素B6[J].理化检验：化学分册，2005（7）：519，521.

[10] GB/T5009.154-2003.食品中维生素B6的测定[S].

[11] 王为黎，马景宏，张旭，张志宏.运用微生物法测定保健食品中的维生素B6[J].中国微生态学杂志，2006，18（4）：291-295.

[12] 张旭，李援，胡英.微生物分析方法测定保健食品中维生素B6的含量[J].中国微生态学杂志，2005，17（6）：477-478.

[13] 陈亚波，周敏，杨彤.微生物法测定维生素饮料中的维生素B6[J].安徽农业科学，2013，41（12）：5502-5503，5509.

（收稿日期：2013-12-02 本文编辑：郭静娟）

图1 维生素B6的标准曲线

2.2 方法的精密度分析

将进行样品处理的4种不同的奶粉样品分别进行6次维生素B6测定，得出不同样品的相对标准偏差（RSD）值（表1）。

表1 精密度分析（n=6）

2.3 方法的加标回收率

将两种不同的奶粉样品，分别加入质量浓度为10、25、50 mg/100 ml的维生素B6标准溶液各10 μl，再按样品处理的步骤进行处理，然后平行测定6次，得到不同样品的加标回收率（表2）。

表2 加标回收试验（n=6）

3 讨论

由于维生素B6是水溶性维生素，在高温、光线直射、空气暴露等环境条件下，会部分降解损失，故在样品提取操作过程中，要尽可能在避光条件下操作，标准溶液应在冷藏、避光条件下保存并尽快分析。含样品的微孔板在30℃培养箱中避光孵育后，将其放于2～8℃冰箱保存，分别于24、48、72 h取微孔板用酶标仪在620 nm条件下测量浑浊度，结果显示48 h内微孔板中的维生素B6性质稳定。

加入微孔中的样品提取液，样品稀释液用水，以及实验中需要的其他耗材都必须无菌。样品无菌提取后，也必须在无菌环境中进行操作。要保证黏合膜和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分，防止样品液在振荡过程中相互混合影响测量结果。检测样品前要估算样品中维生素B6的含量进行稀释，稀释过程要准确，样品的测量OD值在标准曲线中部的结果可信度较高。

微生物法测定维生素B6的含量近50年来虽然已被广泛地纳入各类国际标准方法中，但在我国应用却很少。微生物法操作繁琐、实验周期长，与目前分析方法简便、快速、高效的发展方向所不符[12]。因此，微生物检测试剂盒通过优化样品处理、试剂配制、反应条件，省略了菌种保存及种子培养液的制备[13]，能有效地简化实验步骤，排除实验过程中的各种干扰，从而达到节省实验时间、减轻工作量，进而得到准确的定量结果的目的，同时该方法检出限、线性关系、精密度、加标回收率、稳定性等技术参数能满足奶粉中维生素B6的微量分析的要求，表明该方法可用于测定奶粉中维生素B6的含量，结果令人满意。

[参考文献]

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[8] 曹高娃，崔毅，张力.紫外分光光度法测定维生素B6 [J].光谱实验室，2001，18（6）：802-803.

[9] 陈恕华.紫外分光光度法测定维生素B6[J].理化检验：化学分册，2005（7）：519，521.

[10] GB/T5009.154-2003.食品中维生素B6的测定[S].

[11] 王为黎，马景宏，张旭，张志宏.运用微生物法测定保健食品中的维生素B6[J].中国微生态学杂志，2006，18（4）：291-295.

[12] 张旭，李援，胡英.微生物分析方法测定保健食品中维生素B6的含量[J].中国微生态学杂志，2005，17（6）：477-478.

[13] 陈亚波，周敏，杨彤.微生物法测定维生素饮料中的维生素B6[J].安徽农业科学，2013，41（12）：5502-5503，5509.

（收稿日期：2013-12-02 本文编辑：郭静娟）