HPLC法测定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量

勾晓丹

[摘要] 目的 测定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，为止咳定喘丸的质量研究提供依据。 方法 采用高相液相色谱（HPLC）法测定止咳平喘丸中苦杏仁的活性成分苦杏仁苷的含量；使用Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸（8∶92）为流动相，流量1.0 ml/min。 结果 建立了HPLC法测定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，苦杏仁苷进样量在0.0824～2.0600 μg范围内，线性关系良好（r=0.9995），平均回收率为99.03%，RSD=2.25%（n=6）。 结论 该方法准确、重复性好，可用于止咳平喘丸的质量控制。

[关键词] HPLC；止咳平喘丸；苦杏仁苷

[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0007-03

止咳平喘丸由苦杏仁（炒）、麻黄、石膏、紫苏子（炒）、厚朴（姜制）、陈皮、罂粟壳（蜜炙）、甘草、茶叶等中药材加工制成的复方纯中药制剂[1]，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药方成制剂第三册》[2]。功能主治：清热宣肺，止咳平喘。用于咳嗽气喘，久咳不止。该药原标准过于简单，标准中只对其性状和检查项确定了检验标准，无其他检定方法，对其产品的内在质量无法控制。为控制止咳平喘丸的质量，本实验采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法拟建立止咳平喘丸的质量控制方法，为该制剂的质量控制提供方法，为定量指标提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

岛津LC-2010A型高效液相色谱仪（包括LC-2010型紫外检测器）；LC Solution色谱工作站。

1.2 试剂与试药

乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。苦杏仁苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110820-200403）；止咳定喘丸（东芝堂药业有限公司，批号：130203、130303、130403）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（8∶92）；柱温：30℃；体积流量：1.0 ml/min；检测波长207 nm；进样量10 μl。理论板数：按苦杏仁苷计算应不低于7000，外标法计算含量。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每毫升含80 μg的溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品粉末3.5 g，精密称定，置塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液5 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.2.3 阴性对照液 按处方及工艺制备不含苦杏仁的阴性样品，同供试品溶液的制备方法学考察阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 阴性干扰实验 取“2.2”项下3种溶液各10 μl，分别注入高效液相色谱仪测定。结果色谱图中在苦杏仁苷峰相应的保留时间附近未检出干扰峰（图1）。

图1 止咳定喘丸HPLC色谱图

A.对照品；B.供试品；C.阴性对照

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=117 632X-347 713，r=0.9995。结果表明，苦杏仁苷对照品进样量在0.0824～2.0600 μg范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μl，重复进样6次，记录色谱图，按峰面积计算，结果RSD=0.18%，说明仪器精密度良好。

2.3.4 重现性试验 取同一批号样品6份，分别依法处理后测定。结果RSD=0.64%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一批号样品溶液，在室温条件下放置，按上述色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测得峰面积值RSD=0.78%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品（批号：130203，苦杏仁苷含量为3.28 mg/g）6份，每份0.5 g，精密加入苦杏仁苷对照品溶液（0.1950 mg/ml）2 ml，按供试品溶液方法制备，依法测定含量并计算回收率（表1）。

表1 加样回收率试验结果

2.4 样品含量的测定

取3批样品，按供试品溶液方法制备，分别进样10 μl，依法测定，采用外标法计算样品中苦杏仁苷的含量（表2）。

表2 样品中苦杏仁苷的测定结果（n=5）

3 讨论

本实验中，苦杏仁苷在207 nm处有最大吸收，选用207 nm作检测波长，苦杏仁苷峰有最大峰面积，其他组分在此无干扰吸收。

苦杏仁苷的含量测定方法现多用HPLC法[3]。在实验过程中，曾按照参考文献，用各种比例的甲醇-水、乙腈-水作流动相，发现系统的稳定性太差[4-5]，无法检测，且出现双齿峰，改用乙腈-水后，得到单峰，稳定性明显改善，且灵敏度也有所提高，苦杏仁苷色谱峰基本上达到了基线分离。经过反复实验，最终建立了适合本品的含量测定方法，流动相比例为乙腈-0.1%磷酸（8∶92）。

综合考虑提取分离中药有效成分常用的各种方法的优缺点，本实验以甲醇为溶剂，由于溶剂浸提法、回流提取法和索式提取法提取时间较长，超声提取法提取时间短，且无其他组分峰干扰，因此选择超声提取法作为止咳平喘丸中苦杏仁苷的提取方法[6-7]。

经笔者调研发现，在气候变化明显的季节，尤其是秋冬季节，咳嗽气喘的患者很多。此药功能主治为清热宣肺，止咳平喘。用于咳嗽气喘，久咳不止。用途广泛且有一定的市场占有率，但原标准过于简单，标准中只对其性状和检查项确定了检验标准，无其他检定方法，笔者认为本研究阐述的检验方法专属性强、重现性好、阴性对照无干扰、方法可靠，使止咳定喘丸原有的质量标准得到充实和完善[8-9]，更能准确、有效地控制止咳定喘丸的质量标准。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：187-188.

[2] 卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药方成制剂第三册[M].北京：人民卫生出版社，1991：41.

[3] 袁丹，胡爽，毕开顺，等.HPLC法测定复方制剂中苦杏仁苷含量的研究[J].药物分析杂志，2002，22（5）：361.

[4] 刘小平，李湘南，徐海星.中药分离工程[M].北京：化学工业出版社，2005：60-74.

[5] 井山林，袁铸人，彭国平.杏贝止咳颗粒中苦杏仁苷的HPLC测定[J].中国医药工业杂志，2004，35（2）：104-105.

[6] 王力生，邹节明，袁伟恩，等.苦杏仁的炮制及有效成分提取和分析进展[J].分析测试技术与仪器，2005，11（1）：34-38.

[7] 钟文，唐新，谢培德，等.HPLC测定止带消糜栓中苦杏仁苷的含量[J].中成药，2006，28（5）：766-767.

[8] 何世新，解丹平，封海霞.HPLC测定益肺胶囊中苦杏仁苷的含量[J].中国药事，2007，21（11）：910-913.

[9] 甄攀.麻杏止咳片中杏仁苷的HPLC测定[J].中成药，2003， 25（2）：115-116.

（收稿日期：2013-11-01 本文编辑：林利利）

[摘要] 目的 测定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，为止咳定喘丸的质量研究提供依据。 方法 采用高相液相色谱（HPLC）法测定止咳平喘丸中苦杏仁的活性成分苦杏仁苷的含量；使用Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸（8∶92）为流动相，流量1.0 ml/min。 结果 建立了HPLC法测定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，苦杏仁苷进样量在0.0824～2.0600 μg范围内，线性关系良好（r=0.9995），平均回收率为99.03%，RSD=2.25%（n=6）。 结论 该方法准确、重复性好，可用于止咳平喘丸的质量控制。

[关键词] HPLC；止咳平喘丸；苦杏仁苷

[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0007-03

止咳平喘丸由苦杏仁（炒）、麻黄、石膏、紫苏子（炒）、厚朴（姜制）、陈皮、罂粟壳（蜜炙）、甘草、茶叶等中药材加工制成的复方纯中药制剂[1]，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药方成制剂第三册》[2]。功能主治：清热宣肺，止咳平喘。用于咳嗽气喘，久咳不止。该药原标准过于简单，标准中只对其性状和检查项确定了检验标准，无其他检定方法，对其产品的内在质量无法控制。为控制止咳平喘丸的质量，本实验采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法拟建立止咳平喘丸的质量控制方法，为该制剂的质量控制提供方法，为定量指标提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

岛津LC-2010A型高效液相色谱仪（包括LC-2010型紫外检测器）；LC Solution色谱工作站。

1.2 试剂与试药

乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。苦杏仁苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110820-200403）；止咳定喘丸（东芝堂药业有限公司，批号：130203、130303、130403）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（8∶92）；柱温：30℃；体积流量：1.0 ml/min；检测波长207 nm；进样量10 μl。理论板数：按苦杏仁苷计算应不低于7000，外标法计算含量。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每毫升含80 μg的溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品粉末3.5 g，精密称定，置塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液5 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.2.3 阴性对照液 按处方及工艺制备不含苦杏仁的阴性样品，同供试品溶液的制备方法学考察阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 阴性干扰实验 取“2.2”项下3种溶液各10 μl，分别注入高效液相色谱仪测定。结果色谱图中在苦杏仁苷峰相应的保留时间附近未检出干扰峰（图1）。

图1 止咳定喘丸HPLC色谱图

A.对照品；B.供试品；C.阴性对照

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=117 632X-347 713，r=0.9995。结果表明，苦杏仁苷对照品进样量在0.0824～2.0600 μg范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μl，重复进样6次，记录色谱图，按峰面积计算，结果RSD=0.18%，说明仪器精密度良好。

2.3.4 重现性试验 取同一批号样品6份，分别依法处理后测定。结果RSD=0.64%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一批号样品溶液，在室温条件下放置，按上述色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测得峰面积值RSD=0.78%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品（批号：130203，苦杏仁苷含量为3.28 mg/g）6份，每份0.5 g，精密加入苦杏仁苷对照品溶液（0.1950 mg/ml）2 ml，按供试品溶液方法制备，依法测定含量并计算回收率（表1）。

表1 加样回收率试验结果

2.4 样品含量的测定

取3批样品，按供试品溶液方法制备，分别进样10 μl，依法测定，采用外标法计算样品中苦杏仁苷的含量（表2）。

表2 样品中苦杏仁苷的测定结果（n=5）

3 讨论

本实验中，苦杏仁苷在207 nm处有最大吸收，选用207 nm作检测波长，苦杏仁苷峰有最大峰面积，其他组分在此无干扰吸收。

苦杏仁苷的含量测定方法现多用HPLC法[3]。在实验过程中，曾按照参考文献，用各种比例的甲醇-水、乙腈-水作流动相，发现系统的稳定性太差[4-5]，无法检测，且出现双齿峰，改用乙腈-水后，得到单峰，稳定性明显改善，且灵敏度也有所提高，苦杏仁苷色谱峰基本上达到了基线分离。经过反复实验，最终建立了适合本品的含量测定方法，流动相比例为乙腈-0.1%磷酸（8∶92）。

综合考虑提取分离中药有效成分常用的各种方法的优缺点，本实验以甲醇为溶剂，由于溶剂浸提法、回流提取法和索式提取法提取时间较长，超声提取法提取时间短，且无其他组分峰干扰，因此选择超声提取法作为止咳平喘丸中苦杏仁苷的提取方法[6-7]。

经笔者调研发现，在气候变化明显的季节，尤其是秋冬季节，咳嗽气喘的患者很多。此药功能主治为清热宣肺，止咳平喘。用于咳嗽气喘，久咳不止。用途广泛且有一定的市场占有率，但原标准过于简单，标准中只对其性状和检查项确定了检验标准，无其他检定方法，笔者认为本研究阐述的检验方法专属性强、重现性好、阴性对照无干扰、方法可靠，使止咳定喘丸原有的质量标准得到充实和完善[8-9]，更能准确、有效地控制止咳定喘丸的质量标准。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：187-188.

[2] 卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药方成制剂第三册[M].北京：人民卫生出版社，1991：41.

[3] 袁丹，胡爽，毕开顺，等.HPLC法测定复方制剂中苦杏仁苷含量的研究[J].药物分析杂志，2002，22（5）：361.

[4] 刘小平，李湘南，徐海星.中药分离工程[M].北京：化学工业出版社，2005：60-74.

[5] 井山林，袁铸人，彭国平.杏贝止咳颗粒中苦杏仁苷的HPLC测定[J].中国医药工业杂志，2004，35（2）：104-105.

[6] 王力生，邹节明，袁伟恩，等.苦杏仁的炮制及有效成分提取和分析进展[J].分析测试技术与仪器，2005，11（1）：34-38.

[7] 钟文，唐新，谢培德，等.HPLC测定止带消糜栓中苦杏仁苷的含量[J].中成药，2006，28（5）：766-767.

[8] 何世新，解丹平，封海霞.HPLC测定益肺胶囊中苦杏仁苷的含量[J].中国药事，2007，21（11）：910-913.

[9] 甄攀.麻杏止咳片中杏仁苷的HPLC测定[J].中成药，2003， 25（2）：115-116.

（收稿日期：2013-11-01 本文编辑：林利利）

[摘要] 目的 测定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，为止咳定喘丸的质量研究提供依据。 方法 采用高相液相色谱（HPLC）法测定止咳平喘丸中苦杏仁的活性成分苦杏仁苷的含量；使用Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸（8∶92）为流动相，流量1.0 ml/min。 结果 建立了HPLC法测定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，苦杏仁苷进样量在0.0824～2.0600 μg范围内，线性关系良好（r=0.9995），平均回收率为99.03%，RSD=2.25%（n=6）。 结论 该方法准确、重复性好，可用于止咳平喘丸的质量控制。

[关键词] HPLC；止咳平喘丸；苦杏仁苷

[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0007-03

止咳平喘丸由苦杏仁（炒）、麻黄、石膏、紫苏子（炒）、厚朴（姜制）、陈皮、罂粟壳（蜜炙）、甘草、茶叶等中药材加工制成的复方纯中药制剂[1]，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药方成制剂第三册》[2]。功能主治：清热宣肺，止咳平喘。用于咳嗽气喘，久咳不止。该药原标准过于简单，标准中只对其性状和检查项确定了检验标准，无其他检定方法，对其产品的内在质量无法控制。为控制止咳平喘丸的质量，本实验采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法拟建立止咳平喘丸的质量控制方法，为该制剂的质量控制提供方法，为定量指标提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

岛津LC-2010A型高效液相色谱仪（包括LC-2010型紫外检测器）；LC Solution色谱工作站。

1.2 试剂与试药

乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。苦杏仁苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110820-200403）；止咳定喘丸（东芝堂药业有限公司，批号：130203、130303、130403）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（8∶92）；柱温：30℃；体积流量：1.0 ml/min；检测波长207 nm；进样量10 μl。理论板数：按苦杏仁苷计算应不低于7000，外标法计算含量。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每毫升含80 μg的溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品粉末3.5 g，精密称定，置塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液5 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.2.3 阴性对照液 按处方及工艺制备不含苦杏仁的阴性样品，同供试品溶液的制备方法学考察阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 阴性干扰实验 取“2.2”项下3种溶液各10 μl，分别注入高效液相色谱仪测定。结果色谱图中在苦杏仁苷峰相应的保留时间附近未检出干扰峰（图1）。

图1 止咳定喘丸HPLC色谱图

A.对照品；B.供试品；C.阴性对照

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=117 632X-347 713，r=0.9995。结果表明，苦杏仁苷对照品进样量在0.0824～2.0600 μg范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μl，重复进样6次，记录色谱图，按峰面积计算，结果RSD=0.18%，说明仪器精密度良好。

2.3.4 重现性试验 取同一批号样品6份，分别依法处理后测定。结果RSD=0.64%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一批号样品溶液，在室温条件下放置，按上述色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测得峰面积值RSD=0.78%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品（批号：130203，苦杏仁苷含量为3.28 mg/g）6份，每份0.5 g，精密加入苦杏仁苷对照品溶液（0.1950 mg/ml）2 ml，按供试品溶液方法制备，依法测定含量并计算回收率（表1）。

表1 加样回收率试验结果

2.4 样品含量的测定

取3批样品，按供试品溶液方法制备，分别进样10 μl，依法测定，采用外标法计算样品中苦杏仁苷的含量（表2）。

表2 样品中苦杏仁苷的测定结果（n=5）

3 讨论

本实验中，苦杏仁苷在207 nm处有最大吸收，选用207 nm作检测波长，苦杏仁苷峰有最大峰面积，其他组分在此无干扰吸收。

苦杏仁苷的含量测定方法现多用HPLC法[3]。在实验过程中，曾按照参考文献，用各种比例的甲醇-水、乙腈-水作流动相，发现系统的稳定性太差[4-5]，无法检测，且出现双齿峰，改用乙腈-水后，得到单峰，稳定性明显改善，且灵敏度也有所提高，苦杏仁苷色谱峰基本上达到了基线分离。经过反复实验，最终建立了适合本品的含量测定方法，流动相比例为乙腈-0.1%磷酸（8∶92）。

综合考虑提取分离中药有效成分常用的各种方法的优缺点，本实验以甲醇为溶剂，由于溶剂浸提法、回流提取法和索式提取法提取时间较长，超声提取法提取时间短，且无其他组分峰干扰，因此选择超声提取法作为止咳平喘丸中苦杏仁苷的提取方法[6-7]。

经笔者调研发现，在气候变化明显的季节，尤其是秋冬季节，咳嗽气喘的患者很多。此药功能主治为清热宣肺，止咳平喘。用于咳嗽气喘，久咳不止。用途广泛且有一定的市场占有率，但原标准过于简单，标准中只对其性状和检查项确定了检验标准，无其他检定方法，笔者认为本研究阐述的检验方法专属性强、重现性好、阴性对照无干扰、方法可靠，使止咳定喘丸原有的质量标准得到充实和完善[8-9]，更能准确、有效地控制止咳定喘丸的质量标准。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：187-188.

[2] 卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药方成制剂第三册[M].北京：人民卫生出版社，1991：41.

[3] 袁丹，胡爽，毕开顺，等.HPLC法测定复方制剂中苦杏仁苷含量的研究[J].药物分析杂志，2002，22（5）：361.

[4] 刘小平，李湘南，徐海星.中药分离工程[M].北京：化学工业出版社，2005：60-74.

[5] 井山林，袁铸人，彭国平.杏贝止咳颗粒中苦杏仁苷的HPLC测定[J].中国医药工业杂志，2004，35（2）：104-105.

[6] 王力生，邹节明，袁伟恩，等.苦杏仁的炮制及有效成分提取和分析进展[J].分析测试技术与仪器，2005，11（1）：34-38.

[7] 钟文，唐新，谢培德，等.HPLC测定止带消糜栓中苦杏仁苷的含量[J].中成药，2006，28（5）：766-767.

[8] 何世新，解丹平，封海霞.HPLC测定益肺胶囊中苦杏仁苷的含量[J].中国药事，2007，21（11）：910-913.

[9] 甄攀.麻杏止咳片中杏仁苷的HPLC测定[J].中成药，2003， 25（2）：115-116.

（收稿日期：2013-11-01 本文编辑：林利利）